Культивирование клеток и тканей

Наиболее удобным объектом для медицинских генетиков оказалась культура лимфоцитов периферической крови рис. Рис 1 36 Приготовление цитогенетических препаратов путем культивирования лимфоцитов периферической крови. Использование данных методик пример слияния высоких технологий, науки и экономически выгодного способа получения лекарственного сырья Сбор дикорастущего сырья наносит вред экологической обстановке региона и всей планете целом, а при неправильном сборе может и вовсе привести к вырождению зарослей Культивировать целое растение также не практично если качестве сырья используется, к примеру, только его корневища или корни Это значит, что вся надземная часть лучшем случае идёт на корм животным или просто выбрасывается Культивирование изолированных клеток и тканей даёт возможность получать именно то сырьё которое необходимо, и кроме того позволяет увеличить количество и качество самих биологически активных веществ. В самом общем смысле культура клеток и тканей это искусственное in vitro индицирование делений клеток или выращивание пересадочной культуре тканей, возникших путём пролиферации клеток изолированных сегментов разных частей растения.

Подбор физических и химических условий культивирования является наиболее простым и часто применяемым подходом для повышения продуктивности В основе физиологического регулирования процессов вторичного синтеза лежит изучение влияния факторов культивирования на рост и метаболизм клеток Большое внимание уделяется таким факторам культивирования, как регуляторы роста, минеральные вещества, витамины, сахара, свет, аэрация, температура, а также иммобилизация клеток и обработка элиситорами Во многих случаях эти работы привели к успеху, однако они выполняются эмпирически и поэтому длительны и трудоемки К тому же следует оговориться, что несмотря на эффективность повышения уровня биосинтеза физиологическими методами, добиться количественно значимых изменений недифференцированных клеточных культурах, сопоставимых с уровнем интактном растении, лишь за некоторым исключением, не удается Стимулирование же синтеза элиситорами носит, к сожалению, временный характер. Наиболее серьёзной из них является разработка стратегии контроля синтеза вторичных соединений культивируемых клетках растений До сих пор неясно, возможна ли разработка единой стратегии или она должна быть специфической для разных классов вторичных соединений, или же индивидуальной для каждого конкретного случая.

Основные разновидности живых клеток и особенности их строения Общий план строения эукариотических и прокариотических клеток Особенности строения растительной и грибной клеток Сравнительная таблица строения клеток растений, животных, грибов и бактерий. Изолированные ткани и клетки растений могут успешно расти толь ко при отсутствии конкуренции с микроорганизмами Все работы по культивированию растительных объектов необходимо производить асептических условиях Если состав питательной среды входят термо лабильные вещества, их фильтруют через мембранные стерилизующие фильтры и добавляют простерилизованную среду, охлажденную до. При образовании каллуса культуре in vitro происходит неоргани зованный рост клеток и их дедифференциация, потеря первоначаль ных функций, свойственных ткани или органу, из которых был получен каллус Клетки как бы обезличиваются, их функции практически оди наковы и существуют за счет питательной среды Однако при измене нии условий культивирования можно вызвать вторичную дифферен циацию и получить целое растение По сравнению с клетками живот ных и человека растительные клетки обладают большим преимущест вом Они способны определенных условиях и на соответствующих питательных средах регенерировать целое растение Решающую роль во вторичном образовании органов корней и почек из изолированных клеток и тканей играет соотношение фитогормонов ауксинов и цитокининов и их концентрация питательной среде.

В настоящее время разработаны способы получения новых гибри дов результате слияния изолированных протопластов различных рас тений Поскольку поверхности протопластов имеют отрицательный за ряд, то для их соединения необходимо его нейтрализовать Для индук ции слияния протопласты обрабатывают полиэтиленгликолем Частота слияния протопластов может быть увеличена добавлением декстрана, поливинола или под влиянием электрического поля После слияния происходит регенерация клеточной стенки Она образуется менее чем за сутки, после чего клетки начинают делиться При слиянии протопла стов разных родительских растений образуются новые клетки, из которых через культуру каллуса можно регенерировать новое растение с заданными свойствами. Восстановление целого растения с помощью изолированных куль тур может происходить разными путями. Метод культуры тканей и клеток успешно используется для выве дения новых сортов, том числе и высокопродуктивных лекарственных растений Для создания нового сорта классическим способом грунте требовалось 10 30 лет Благодаря методу культуры тканей этот период можно сократить до нескольких месяцев, поскольку сезонность значе ния не имеет. В качестве дополнительного источника азота состав сред добавляют аминокислоты ааланин, глутаминовую кислоту, глицин, аргинин, аспарагиновую кислоту или гидролизат казеина источник аминокислот.

В культуре изолированных тканей растений действие аминокислот значительно варьирует для разных тканей и разных физиологических состояний вводимых культуру эксплантов Полностью заменить нитраты как источник азота способны аланин, аргинин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты, гликокол, аспарагин, пролин. Действие витаминов на рост культуры тканей зависит от способности ткани синтезировать их оптимальном или субоптимальном количестве и от состава других компонентов питательной смеси, с которыми витамины могут взаимодействовать синергически или антагонистически Интересно, что клеточная суспензия, полученная путем помещения ткани жидкую среду, при пассировании значительно более чувствительна к недостатку витаминов, чем сама ткань Исключение из среды холина и аскорбиновой кислоты приводит к увеличению одиночных суспендированных клеток Следует отметить, что каждом конкретном случае место отдельного витамина сложной цепи метаболизма различно.

В настоящее время существует большое количество различных прописей питательных сред для культивирования изолированных тканей и клеток Их состав зависит от задач культивирования, видов растений и типов эксплантов Наиболее часто используемая среда Мурасиге и Скуга, впервые была составлена и предложена 1962 Кроме того, настоящее время широко известны среды Уайта, Нича, В5, N6 и др табл 4 1, отличающиеся набором отдельных составляющих компонентов и их соотношением Существуют и коммерческие препараты питательных сред, выпускаемые иностранными и российскими фирмами. Одно из направлений клеточных технологий это использование их селекции, которое облегчает и ускоряет традиционный селекционный процесс создании новых форм и сортов растений Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей invitro условно можно разделить на две группы. Гаплоидные особи стерильны, но можно искусственно удвоить набор их хромосом с помощью колхицина и получить диплоидные гомозиготные растения.

Продолжается разработка технологии получения гаплоидов посредством культуры пыльников пшеницы, ячменя, кукурузы, озимой ржи, картофеля В культуре пыльников возможны два пути образования гаплоидных растений Первый образование растений путем эмбриогенеза пыльцевых зернах При этом внутри пыльников из отдельных пыльцевых зерен возникают эмбриоиды Они прорастают и дают гаплоидные растения Второй образование каллуса из клеток пыльника В дальнейшем результате морфогенеза из каллусных клеток регенерируют растения В этом случае образовавшиеся растения не всегда бывают гаплоидными и часто отличаются по плоидности До конца не выяснено, образуются ли они от полиплоидизированных гаплоидных клеток или от слившихся клеток. Для определения жизнеспособности клеток после оттаивания применяют наиболее простой, быстрый и вполне удовлетворительный способ окраска витальным красителем 0, 1 ным феносафранином или 0, 25 ным раствором сини Эванса, результате которой мертвые клетки окрашиваются, а живые нет Окончательным критерием, безусловно, служит четкое возобновление роста и деления клеток при рекультивации на искусственных питательных средах после оттаивания.

Таким образом, технология, связанная с криосохранением растительных объектов, развивается и постоянно совершенствуется Несомненно, эта технология имеет свое будущее, так как уже сегодня криобанки могут значительно облегчить работу селекционеров, предоставив им возможность широко использовать пул генов сортов, том числе старой селекции и диких видов, а также исчезающих видов растений. Сомаклональная вариабельность Метод культуры изолированных клеток, тканей и органов растений invitro, широко используемый для решения многих фундаментальных вопросов клеточной биологии, физиологии и генетики растений, настоящее время находит все большее применение и при создании новых биотехнологий Начиная с первых работ по культивированию растительных клеток, тканей и органов особый интерес у исследователей вызвал вопрос о том, какие клеточные изменения могут происходить изолированных клетках, растущих на искусственных питательных средах, и причины, их вызывающие С разработкой техники получения растенийрегенерантов из каллусной ткани появилась возможность получать новые формы растений, отличающиеся как по фенотипическим, так и по генетическим признакам от исходных растений Такое разнообразие среди клеточных линий и растенийрегенерантов получило название сомаклоны, хотя еще 70 80е годы нашего столетия было принято называть растения, регенерировавшие из каллусной ткани, калликлонами, а из протопластов протоклонами.

Сомаклональную изменчивость можно проследить на молекулярном уровне, оценивая тонкие перестройки ядерной. Таким образом, полученные положительные результаты свидетельствуют о необходимости более эффективного внедрения различных приемов получения сомаклональных вариантов практику селекционной работы, и наиболее реальным является применение сомаклональной изменчивости для улучшения или доработки уже существующих сортов или линий по отдельным недостающим признакам. Выделение, культивирование и слияние изолированных протопластов Для применения методов соматической гибридизации необходима разработка соответствующих технологий получения протопластов, способных делиться и регенерировать растения Выделение протопластов растительных клеток путем их плазмолизирования и механического разрушения клеточной стенки было осуществлено еще конце прошлого века Однако метод изолированных протопластов получил развитие лишь после того, как 1960 И К Коккинг впервые осуществил ферментативное разрушение клеточной стенки и выделил голые протопласты.

Под методом физиологической комплементации, который также используется для обнаружения соматических гибридов, подразумевают способность гибридных клеток жить и размножаться либо переходить к морфогенезу условиях культуры, при которых родительские клетки этого делать не состоянии, причем неспособность родительских клеток не связана с какойнибудь определенной мутацией, а является нормальной физиологической реакцией клетки на физиологические условия Например, половые гибриды между N glauca и N Langsdorfii имеют склонность к опухолеобразованию, а клетки гибридов условиях invitro способны расти и размножаться на питательных средах без гормонов Гормононезависимость клеток гибрида и была положена основу метода селекции После индуцированного слияния протопластов из мезофилла листьев обоих видов табака клетки через некоторое время пересаживали на питательную среду, не содержащую фитогормонов, и отбирали колонии, способные расти этих условиях Существуют также другие методы селекции соматических гибридов смешанная физиологогенетическая комплементация, физическое обогащение метод основан на разделении протопластов при центрифугировании связи с их различной плотностью, механическая изоляция. Рис 1 Однослойная монослойная культура клеток на всем поле зрения видны клетки китайского хомячка, растущие на стекле.

Общим для современных способов получения первичных трипсинизированных однослойных культур является обработка тканей трипсином, реже химотрипсином, папаином, панкреатином, гиалуронидазой, коллагеназой В стерильных условиях ткань измельчают, промывают и помещают рре фермента на магнитную мешалку Полученную суспензию клеток центрифугируют, осадок клеток разводят ростовой средой до оптимальной концентрации зависимости от типа клеточных культур от 100 000 до 500 000 клеток на 1 мл среды После посева культуральные флаконы клетки прикрепляются к стеклу и адаптируются к условиям in vitro фаза стабилизации, lagфаза, затем они начинают активно пролиферировать фаза логарифмического роста, logфаза, вступая стационарную фазу с образованием монослоя рис. Культуры клеток и тканей широко применяются радиобиологии Интерес к ним обусловлен возможностью изучать радиационную патологию клетки, изолированную от влияния других клеточных систем или нейрогуморальных факторов, которые имеют место организме. В условиях К к и закономерно воспроизводится феномен канцерогенеза или малигнизации нормальных клеток Малигнизация клеток К к и может происходить под воздействием онкогенных вирусов, хим канцерогенных веществ, а также без специальных воздействий спонтанно.

Рис 9 Развитие эпителиоподобных гетероплоидных клеток клеточной линии CaVe из карциномы желудка человека а гистологический срез исходной солидной карциномы желудка окраска гематоксилинэозином, 80 трансформация культуры через 1, 5 2 месяца после посева исходной опухоли стрелками указано появление островков эпителиоподобных клетках окраска гематоксилином, X 80 монослой однородных эпителиоподобных клеток нативный препарат Эксплантация опухолей человека преследовала цель получить длительные культуры опухолевых клеток Однако при выращивании на слое плазмы энергия роста культур ослабевала и клетки гибли Лишь разработка методики однослойных культур с применением синтетических питательных сред позволила длительно поддерживать рост и размножение опухолевых клеток человека и животных В условиях монослоя, как и на слое плазмы, продолжительность жизни опухолевых клеток ограничена, если культуре не наступят изменения, выражающиеся появлении эпителиоподобных гетероплоидных клеток, которые вытесняют иные клеточные формы рис 9 Клетки таких трансформированных культур опухолей способны к неограниченному росту вне организма В трансформации не исключается роль вирусов, мутагенных веществ, радиации и.

Культуры клеток и тканей используются для изучения эффектов и механизмов действия различных биол физ и хим агентов Важно использование К к и для изучения химиотерапевтических препаратов, применяемых онкол клинике, и отбора новых противоопухолевых веществ Критериями биологического цитотоксического действия таких веществ могут быть общее количество и число погибших и жизнеспособных клеток, содержание культурах белка и нуклеиновых кт, степень угнетения ферментов, уровень включения клетками радиоактивных предшественников синтеза нуклеиновых кт, белка и Культуры клеток и тканей позволяют отбирать потенциально противоопухолевые цитотоксические вещества, то время как исследование их специфической противоопухолевой активности возможно лишь опытах на животных. Костный мозг является незаменимым объектом для изучения процессов пролиферации и дифференцировки клеток вообще и кроветворных клеток особенности Он представляет собой гетерогенную клеточную популяцию, состоящую из пролиферирующих и дифференцирующихся клеток Дифференцировка протекает виде ряда последовательных стадий, легко различимых функционально или морфологически В отличие от большинства других тканей, костный мозг может быть легко получен от живого человека.

Основное назначение таких культур заключается выявлении различных категорий клетокпредшественников, клеток, способных проделать достаточное число делений для образования клона из нескольких десятков тысяч клеток см Кроветворение Необходимые условия для получения клонального роста среда, обеспечивающая относительную иммобилизацию клеток чтобы клеткипотомки не мигрировали далеко из зоны пролиферации, низкая плотность посева чтобы клоны не перекрывали друг друга и присутствие среде факторов, способствующих пролиферации и дифференцировке клонообразуюших клеток Эти условия удалось выполнить для клетокпредшественников всех трех ростков кроветворения. Культивирование клеток предшественников мегакариоцитов Эти предшественники образуют колонии магакариоцитов агаровых культурах присутствии меркаптоэтанола конечная концентрация 5 X 10 5 М В качестве источника колониестимулирующей активности используют кондиционированную среду культур лимфоцитов селезенки Длительность культивирования 7 10 дней. Оказалось, что клетки стромальных предшественников при стабильном кроветворении организме не пролиферируют Они способны при трансплантации построить строму костного мозга, на крую происходит репопуляция кроветворных клеток, и возникает очаг эктопического кроветворения.

Такой вариант культур наряду с очевидными недостатками невозможность изучения гуморальных факторов, особенностей питания, природы регуляторов и имеет ряд преимуществ простота, хорошая воспроизводимость, несложность сред, лучшие условия для клеток, что делает метод все более популярным С его помощью изучены кинетика превращения исходных культур камерах, направление дифференцировки кроветворных клеток, межклеточные взаимодействия двойных камерах, разделенных фильтром. В настоящее время изолированные клетки и ткани культивируют на многокомпонентных питательных средах, которые отличаются по своему составу зависимости от вида культуры В состав всех питательных сред обяхательно входят необходимые растению макроэлементы Лучшей формой азотного питания являются нитраты калия или аммония, некоторых случаях дополнительно используются аминокислоты Кроме азотистых соединений необходимы фосфор, сера, кальций, сульфаты Отсутствие питательной среде микроэлементов уже первом пассаже пересадке может уменьшить интенсивность роста тканей на 3040, а при последующих гибель тканей В зависимости от вида изолированной культуры могут небольших количествах использоваться железо, бор, цинк, марганец, медь, алюминий, никель, йод. Для успешного роста культур необходимы также источники углерода, поскольку даже зеленеющие, выращиваемые на свету ткани неаутоттрофны Лучшим источником углеводного питания, является сахароза, используемая обычно концентрации 25 Реже используется глюкоза или другие сахара.

Протопласт это клетка, лишенная оболочки Такая голая клетка потенциально способна восстанавливать новую оболочку, делиться, образовывать клеточные агрегаты, из которых можно получить клеточную культуру с новыми свойствами, а затем новое растение регенерант Отсутствие клеточной стенки облегчает проведение различных генетических манипуляций, связанных с реконструированием генома, а также дает возможность получать популяции гибридных клеток результате слияния протопластов. Существует два способа разрушения клеточной оболочки механический и ферментативный Последний менее травматичен для клеток и чаще используется Для получения протопластов растительный материал например, суспензия клеток мезофилла листа или суспензия культуры изолированных клеток обрабатывается препаратами пектиназ и целлюлаз или более сложными смесями ферментов Для получения суспензии клеток целого растения предпочтительнее использовать листья стерильных растений, культивируемых in vitro, поскольку при получении голых протопластов также необходимо соблюдать стерильность. Слиянием протопластов получен гибрид томата и картофеля томофель, гибриды некоторых лекарственных растений дурмана индийского и белладонны, скополии гималайской и белладонны, гибрид двух видов дурмана, содержащий на 25 больше тропановых алкалоидов, чем родительское растение.

Следует подчеркнуть, что такой своеобразный способ вегетативного размножения основан на свойстве тотипотентности растительных ниток, это по сути клонирование растений В отличие от клонирования животных, которое очень активно обсуждается лишь последнее десятилетие, метод микроклонального размножения, растений используется уже более 40 лет Впервые этот метод успешно применил французский исследователь Ж Морель 1960 для размножения орхидеи Из одного безвирусного экспланта ему удалось течение года получить около 4 млн новых растений, свободных от вирусной инфекции Метод клонального микроразмножения может использоваться для создания элитного и суперэлитного посадочного материала. В Германии разработали способ получения кислоты розмариновой из культуры клеток каллуса Кислота розмариновая вещество, обладающее противоопухолевой активностью, и природный антибиотик широкого спектра действия Из культуры клеток табака получен убихинон 10 На основе убихинона получают препарат для лечения инсультов и купирования спаечных процессов. Наряду с культурами клеток и тканей растений развиваются способы культивирования органов растений in vitro например, культивирование волосатых корней, измененных с помощью бактерий рода Agrobacterium, качестве альтернативного источника продуктов жизнедеятельности растений, где по условиям роста и скопления клеток возникают субпопуляции с повышенной дифференци ровкой, самые продуктивные клетки по.

Ткани, культивируемые in vitro, перед помещением на питательную среду должны быть стерильными Стерилизуются исходные кусочки ткани растений, питательная среда асептически специальных боксах стерильным инструментом проводятся манипуляции с выращиванием объектов Чашки Петри, пробир. Рис 2 Схема получения каллусной и суспензионной культур растений, а также из них растенийрегенератов. Условия культивирования Питание Важнейшим фактором создания эффективной биотехнологической системы является разработка питательной среды, которая обеспечивает потребности продуцента химических компонентах, требуемых для оптимального синтеза целевого продукта. В среде, где все питательные вещества избытке, увеличение концентрации сахарозы, как правило, приводит к увеличению биомассы В некоторых случаях увели чение сахарозы может оказать положительный эффект и на выход действующих веществ Так, культуре ткани катаранта розового при увеличении концентрации сахарозы 4 раза концентрации серпентина и антоцианов увеличились 2, 6 раза Концентрация алкалоидов клетках растений эшшольция Eschscholtsia Cham увеличивалась 7 раз при увеличении концентрации сахарозы 4 раза Но содержание фенольных соединений, продуцируемых этими клетками, не изменилось, что указывает на независимую регуляцию различных биосинтетических путей.

Таким образом, научной основой биотехнологического использования культур тканей растений фармакогнозии является способность клеток in vitro синтезировать самые разнообразные группы веществ гликозиды, фенольные соединения, кардиостероиды, сапонины, лигнаны, флавоноиды, терпеноиды, алкалоиды и другие природные соединения Все они звенья сложных цепей метаболизма у растений, где выполняют определенные, часто весьма важные, функции. Лит Методы культивирования клеток Л 1988 Культура животных клеток Методы Под редакцией Р Фрешни М 1989 Биология культивируемых клеток и биотехнология растений М 1991 Freshney R I Culture of animal cells а manl of basic technique 5th ed Hoboken Интерес к клеточным культурам беспозвоночных связан с разнообразием и оригинальностью роста и метаморфоза, которые могут быть объектом для изучения основных процессов клеточной дифференцировки и регуляции активности генов С другой стороны, при рассмотрении способов получения энтомопатогенных препаратов отмечалось, что вирусы могут размножаться только при использовании живых клеток насекомых, связи с чем для получения вирусных препаратов необходимым условием являлось предварительное разведение насекомыххозяев Использование клеточных культур беспозвоночных позволяет решить эту проблему. Методика получения первичных культур клеток насекомых достаточно отработана Она включает следующие этапы стерилизация поверхности насекомых и подлежащих культивированию тканей диссоциация клеток пересадка их на питательную среду.

Срок жизни первичных клеточных культур ограничен Через определенное время культура стареет, что проявляется грануляции цитоплазмы, сморщивании и округлении клеток, потери связей между клетками и твердым субстратом. Клеточные культуры насекомых имеют ряд преимуществ по сравнению с клетками млекопитающих как объект биотехнологических производств возможность культивирования при комнатной температуре, дешевизна культуральных сред, отсутствие необходимости CO 2 инкубаторах, высокая плотность культуре. Методы культивирования бактерий и простейших относительно просты наибольшей сложностью характеризуются методы культивирования тканей Среди них различаются культуры кусочков органов, кусочков тканей и отдельных клеток, выделенных из многоклеточного организма Методика культивирования кусочков тканей разнообразна, но наиболее широко распространено культивирование висячей капле и чашке или флаконе Карреля.

Метод культуры тканей и клеток за время своего 50летнего существования нашел широкое применение при изучении различных вопросов биологии и медицины, но особенно прочно он укрепился области вирусологии и онкологии Методика культивирования тканей претерпела за эти 50 лет существенные изменения, однако значительный прогресс получении массовых культур определенного вида клеток был достигнут лишь последние годы Это имело существенное значение для практического применения культур области вирусологии В области экспериментальной онкологии эксплантация клеток и тканей применяется при изучении самых различных вопросов этой науки. Так как сбалансированные солевые растворы применяются смеси с другими ингредиентами, входящими состав питательной среды сыворотка, эмбриональный экстракт, плазма, различия их составе не имеют существенного значения для успешности культивирования тканей млекопитающих и человека Однако при использовании жидкости Хенкса приходится уделять большее внимание поддержанию pH среды, так как она содержит меньше буферных соединений, чем жидкость Эрла Для культивирования тканей холоднокровных применяют солевые растворы другого состава с иным осмотическим давлением этот вопрос здесь не рассматривается.

Кровяная плазма Плазма классических методиках считалась обязательной составной частью питательных сред, однако новейших методиках, особенно при культивировании клеточной взвесью, питательные среды не содержат свернувшейся плазмы Свернувшаяся плазма является твердым субстратом для роста тканей, особенно соединительной фибробластов и нейроглиальной Берут ее у животного или из сердца, из крупной артерии, или из вены Чаще всего для этой цели используют птиц кур или гусей, у которых кровь берут из сонной артерии через канюлю либо из шейной или подкрыльцовой вены шприцем Для предохранения от свертывания можно пользоваться антикоагулянтами, например, гепарином, или собирать кровь охлажденные парафинированные пробирки для центрифуги.

Тканевые экстракты В старых методиках, как правило, применяется эмбриональный куриный экстракт, который обладает выраженным стимулирующим действием на рост и размножение клеток и легко приготовляется Для этой цели обычно используют 11дневных куриных эмбрионов, которых стерильно извлекают из яиц и после освобождения от оболочек гомогенизируют с одинаковым объемом солевого раствора путем растирания ступке с песком или пробирке стеклянной палочкой о стенку последней, либо, что лучше и быстрее, специальных аппаратах, например, измельчителях Надосадочную жидкость, полученную после центрифугирования, считают эмбриональным соком, разбавленным известным количеством солевого раствора Чаще готовят 50 эмбриональный экстракт и добавляют его таком количестве, чтобы по отношению ко всем ингредиентам питательной среды его концентрация составляла.

Для более медленно растущих культур лучше применять методику подкармливания, например по способу А А Максимова Для этого культуры помещают на небольшие слюдяные пластинки твердую фазу из кровяной плазмы с добавлением соответствующей жидкости, слюдяную пластинку прикрепляют капелькой солевого раствора к слюдяной пластинке более крупного размера и к большому покровному стеклу, которое опрокидывают над луночкой предметного стекла Часто поверх твердой фазы наносят капельку жидкой фазы из разведенного эмбрионального экстракта, кровяной сыворотки или их смеси Через несколько дней слюдяную пластинку с культурой споласкивают солевом растворе и производят подкармливание, наносят свежую каплю питательной жидкости на поверхность твердой фазы, а случае ее разжижения прибавляют небольшое количество плазмы Пассирование производят после нескольких подкармливаний, когда зона роста достигла достаточных размеров. Флаконы Карреля с применением свернувшейся плазмы Это одна из наиболее распространенных методик культивирования тканей, которая не утратила до настоящего времени своего значения Однако она начинает уступать более новым методикам приготовления однослойных культур на твердом субстрате стекле или целлофане без свернувшейся плазмы.

Метод культивирования с применением свертка фибрина, как указано выше, не потерял своего значения и до настоящего времени, так как благодаря особенностям строение твердой фазы из тонких переплетающихся нитей фибрина создаются особенно благоприятные условия для роста некоторых тканей не виде отдельных клеточных комплексов, а виде взаимно связанной системы, которой клеточные элементы благодаря своим отросткам образуют как бы единое целое По особенностям роста таких культур удается определять тканевой тип растущей ткани, изучать явления ее дифференцировки и дедифференцировки, взаимоотношения тканей при их совместном культивировании. Для вращения пробирок применяют специально устроенные барабаны, ось которых образует около 15 с горизонтальной плоскостью, что предохраняет от затекания жидкой фазы культур отверстие пробирки, которая закрывается гуттаперчевой пробкой или резиновым колпачком Количество твердой и жидкой фаз сильно варьирует зависимости от размеров пробирки и количества посаженного материала.

Культивирование губчатой массе Попытка приблизить условия роста и размножения клеток к условиям целого организма вызвала появление некоторых методик, которых рост культур происходит каналах и щелях специально приготовленной основы В качестве последней используют перфорированный целлофан, который можно употреблять виде несколько наложенных друг на друга пластинок между ними помещают взвесь клеток или измельченные кусочки ткани Более широкое применение нашла методика, предложенная Лейтоном, где рост культур происходит целлюлозной губке, среде из свернувшейся плазмы. О способе применения трипсина для получения клеточной взвеси упоминалось соответствующей статье Здесь мы укажем лишь на способ получения клеточной взвеси для счета клеток случае культивирования плазматическом свертке Раствор трипсина должен покрывать культуры вместе со свертком фибрина на высоту 2 5 мм Переваривание происходит при pH 7 4 7 6 при комнатной температуре или термостате Рекомендуется приводить движение жидкость тем или другим способом, а также освободить сверток от поверхности стекла Переваривание свертка и освобождение клеток требует от 15 до 15 минут Не рекомендуется дожидаться переваривания центральной части культуры, так как периферические клетки могут быть при этом повреждены энзимом Для этих целей употребляется 0, 5 раствор трипсина.

На практике клеточная инженерия используется при селекции, получении ценных метаболитов растительного происхождения, например, дешевых лекарств, безвирусных растений, их клональное размножение. В 1955 Ф Скуг и С Миллер открыли новый класс фитогормонов цитокинины При их совместном действии с другими фитогормонами ауксинами появилась возможность стимулировать деление клеток, поддерживать рост каллусной ткани, индуцировать морфогенез контролирумых условиях. Универсальной является среда Мурасиге и Скуга, она пригодна для образования каллусов, поддержания неорганизованного каллусного роста, индукции морфогенеза у большинства двудольных растений. Наряду с общими у каллусных клеток появляются свои, характерные для них, особенности Например, длительно культивируемые in vitro клетки высших растений образуют специфическую популяцию, относящуюся к типу неполовых популяции соматических клеток Наиболее характерные свойства этой популяции физиологическая асинхронность, генетическая гетерогенность, гормоннезависимость. Полиплодия наследственное изменение, заключается кратном увеличении числа наборов хромосом клетках организма часто встречается у растений, редко у животных Полиплоды могут содержать клетке три основных набора хромосом триплоид, четыре набора тетраплоид. Однако генетическую гетерогенность нельзя рассматривать как недостаток, так как она является необходимым условием следующей популяции клеток и служит основой для их адаптации Это свойство имеет важное значение для селекции.

Гормоннезависимость Хотя гормоны и вызывают мутации, каллусные ткани от большинства растений образуются только присутствии питательной среде и ауксинов, и цитоксинов Однако, при длительном культивировании практически у всех тканей может возникнуть специфическое свойство гормоннезависимости, то есть автономности по отношению к ауксинам и цитокининам Эти ткани могут расти на среде без гормонов, что делает их похожими на раковые клетки и резко отличает от нормальных каллусных тканей. Изолированные протопласты можно культивировать На питательной среде у протопласта образуется клеточная стенка, после чего он ведет себя как изолированная клетка и способен делиться и формировать клон клеток Регенерация целых растений из изолированных протопластов сложна. На третьей стадии образуется метан Он может синтезироваться через стадию восстановления углекислого газа с молекулярным водородом, а также из метильной группы ацетата Некоторые метановые бактерии качестве субстрата используют формиат, углекислый газ, метанол, метиламин и ароматические соединения. Для культивирования вне организма живые клетки могут быть получены несколькими способами Клетки могут быть выделены из крови, но к росту культуре способны только лейкоциты Моноядерные клетки могут быть выделены из мягких тканей с помощью таких ферментов как коллагеназа трипсин проназа разрушающих внеклеточный матрикс 3 Кроме того, питательную среду можно поместить кусочки тканей.

При работе с клеточными культурами учёные могут столкнуться с проблемой перекрёстного загрязнения. Накопление культуре омертвевших клеток, прекративших жизнедеятельность. Культивирование человеческих клеток несколько противоречит правилам биоэтики поскольку изолированно выращиваемые клетки могут пережить родительский организм, а затем использоваться для проведения экспериментов или для разработки новых методов лечения и извлечения из этого прибыли Первое судебное решение данной области было вынесено Верховном суде штата Калифорния по делу Джон Мур против представителей Калифорнийского университета, согласно которому пациенты не имеют никаких прав собственности на линии клеток, полученных из органов, удаленных с их согласия. Гибридома это линия клеток, полученная результате слияния нормальных лимфоцитов с бессмертными раковыми клетками Используется для получения моноклональных антител Лейкоциты, выделенные из селезенки или крови иммунизированных животных, производят антитела с необходимой специфичностью, но как у любой первичной культуры, их способность к пролиферации ограничена лимитом Хейфлика Для иммортализации их искусственно сливают с бессмертной линией клеток миеломы результате чего происходит рекомбинация признаков После этого линию клонируют и отбирают клоны, способные одновременно к неограниченной пролиферации и производящие антитела против избранного антигена. В этом случае культура клеток сама служит средой для роста и репликации вируса.

Согласно замыслу одного из участников Википедии, на этом месте должен располагаться специальный раздел Вы можете помочь проекту, написав этот раздел. Наиболее распространенным способом реализации этого подхода является формирование более или менее сложных по составу объемных гелей непосредственно из смесей изолированных вышеупомянутых высокомолекулярных соединений В другом варианте синтезирован поперечносшитый полиакриламидный гель, включающий свою структуру коллагены крысы или свиньи, пространстве тонкослойной пористой мембраны из политетрафторэтилена При этом диссоциированные клетки включаются поры таких структур и образуют объемную тканеподобную систему, благоприятствующую росту и функционированию клеток. С другой стороны, описан случай из клинической практики, заключающийся успешном терапевтическом использовании чужеродного неклеточного дермального эквивалента ксенографта кожи Свежевыделенную кожу свиньи подвергали мягкой обработке трипсином для удаления всех клеточных компонентов и получившуюся бесклеточную мембрану, которая, как отмечается, основном сохранила всю морфологию волокон интактного дермиса, использовали для покрытия сквозной кожной раны Наблюдались замечательные эффекты миграции и пролиферации собственных клеток ложе раны, но без какоголибо отторжения ксенографта В результате коллагеновый ксенографт, включающий очевидно и все остальные компоненты базальной мембраны, деградировал и прогрессивно заместился грануляцинной тканью реципиента.

Первая группа это вспомогательные технологии, которые не подменяют обычную селекцию, а служат ей К ним можно отнести оплодотворение in vitro преодоление программной несовместимости, культивирование семяпочек и незрелых гибридных зародышей преодоление постгамной несовместимости, получение гаплоидов путем культивирования пыльников и микроспор, криосохранение изолированных клеток, тканей и органов, клональное микроразмножение отдаленных гибридов. Лекция 3 Принципы культивирования клеток и тканей высших растений 1 Создание условий асептики 2 Питательные среды 3 Цитогенетические особенности культивируемых презентация. Здравствуйте читатели моего проекта Биология для студентов Подготовка к экзаменам, зачетам и госэкзаменам, а также рефераты и презентации занимают много времени, если готовится по учебникам Есть три способа подготовки к экзамену по учебнику, по лекциям и поиск интернете Готовиться по учебнику очень долго Что касается лекций, не у всех есть хорошие лекции, так как не все преподаватели их нормально читают, и кроме того не все успевают их записывать И остается третий вариант искать ответы на вопросы интернете Не для кого не секрет, что настоящее время большинство студентов предпочитают именно этот вариант.

В XIX веке английский физиолог С Рингер разработал солевой раствор, содержащий хлориды натрия, калия, кальция и магния для поддержания биения сердца животных вне организма В 1885 году Вильгельм Ру установил принцип культивирования тканей, извлек часть костного мозга из куриного эмбриона и держал его теплом физрастворе течение нескольких дней 2 Росс Гранвилл Харрисон, работавший Медицинской школе Дж Хопкинса, а затем Йельском университете, опубликовал результаты своих экспериментов 1907 1910 годах, создав методологию культивирования тканей Методы культивирования клеток получили значительное развитие 1940х 1950х годах связи с исследованиями области вирусологии Выращивание вирусов культурах клеток дало возможность получения чистого вирусного материала для производства вакцин Вакцина против полиомиелита стала одним из первых препаратов, массово произведенных с использованием технологии культивирования клеток. Функции углеводов 1 Энергетическая основная функция углеводов источник энергии клетке при окислении 1 углеводов выделяется 17, 6 к Дж энергии реализуетс. Первичная структура белковой молекулы представляет линейную последовательность аминокислотных остатков полипептидной цепи линейный биополимер каждый вид белка характеризуется строго определённой последовательн. Первичная структура впервые установлена 1950 году американским биохимиком Э Чаргаффом апериодичная линейная последовательность дезоксирибонуклеотидов их количество исчисляется сотнями тысяч и миллио.

Строение мембран Толщина мембран колеблется от 6 до 20 нм и её можно наблюдать только электронный микроскоп Основная модель жидкостно мозаичная жидкокристаллическая Сингер Никол. Ядрышко q Внутриядерная немембранная структура эукариотических клеток расположенная матриксе округлое тельце диаметром около 1 2 мкм форма размеры и количество ядрышек зависят от функционально. Функции включений 1 Запас питательных веществ липидов полисахаридов белков 2 Депо ферментов клетках поджелудочной железы зимогеновые гранулы 3 Накопление продуктов подл. Типы гетеротрофного питания Процесс потребления энергии и вещества называется питанием В зависимости от источника пищи выделяют два основных способа гетеротрофного питания голозойный и голофитн. Экологическая роль хемосинтеза Нитрифицирующие бактерии широко распространены природе они встречаются почве и водоёмах и участвуют осуществлении круговорота природе весьма крупных масштабах Серобактери. Процессы интерфазы Включает три периода 1 Пресинтетический или постмитотический G1 следует непосредственно за делением клетки самый продолжи. Биологическое значение мейоза 1 Образование гаплоидных клеток с редуцированным вдвое по сравнению с материнской клеткой числом хромосом гамет или спор 2 Поддержание постоянства кариотипа вида ряду. Значение размножения 1 Увеличение числа особей компенсация снижения численности популяций и видов вследствие естественной гибели особей замещение умерших вновь родившимися 2 Сохранение складывающихся.

Деление Самая простая форма бесполого размножения свойственная одноклеточным организмам у многоклеточных организмов происходит рост и обновление тканей Исходная клетка делится митотическ. Провизорные органы зародышей позвоночных Провизорные или временные органы органы образующиеся эмбриогенезе животных для обеспечения жизненно важных функций дыхание питание. Внешние структуры бактериальной клетки Клетка бактерий покрыта тремя оболочками 11 Капсула слизистые и клейкие выделения состоящие из полисахаридов или полипептидов с содержанием воды. Значение архебактерий Изучение структурнофункциональной организации архебактерий позволяет глубже познать происхождение и эволюцию живых существ жизнь архебактерий протекает условиях которые превалировали на. Цитоплазматическая наследственность Имеются данные необъснимые с точки зрения хромосомной теории наследственности А Вейсмана и Т Моргана исключительно ядерной локализации генов Цитоплазма участвует. Частота мутаций Частота мутирования оьтдельных генов широко варьирут и зависит от состояния организма и этапа онтогенеза обычно растёт с возрастом В среднем каждый ген мутирует один раз 40 тысяч. Генетика и медицина медицинская генетика Изучает причины возникновения диагностические признаки возможности реабилитации и профилактики наследственных болезней человека мониторинг генетических аномалий.

Гибридизация скрещивание Позволяет сочетать определённые наследственные признаки одном организме а также избавляться от нежелательных свойств В селекции применяют различные системы скрещивания эукариоты одноклеточные водоросли грибы простейшие широко используются промышленности сельском хозяйстве медици. Этапы технологического процесса микробиологического синтеза I этап получение чистой культуры микроорганизмов содержащей лишь организмы одного вида или штамма Каждый вид хранится отдельной пробирке и поступает на производство. Хромосомная инженерия у растений Заключается возможности биотехнологической замены отдельных хромосом гаметах растений или добавления новых В клетках каждого диплоидного организма имеются пары гомологичных хромосо. Биогеотехнология Биогеотехнология использование геохимической деятельности микроорганизмов горнодобывающей промышленности рудной нефтяной угольной С помощью микроо. Круговорот серы Сера биогенный элемент живой материи содержится белках составе аминокислот до 2, 5 входит состав витаминов гликозидов коферментов имеется растительных эфирных маслах. Кислотные осадки q Увеличение кислотности дождей снега туманов вследствие выброса атмосферу окислов серы и азота от горения топлива q Кислые осадки снижают урожай губят естественную растительность.

III Возникновение процесса самовоспроизведения молекул биогенного матричного синтеза биополимеров 1 Произошло вследствие взаимодействия коацерватов с нуклеиновыми кислотами 2 Все необходимые компоненты процесса биогенного матричного синтеза ферменты белки. Дрейф генов генетикоавтоматические процессы Дрейф генов генетикоавтоматические процессы случайное ненаправленное не обусловленное действием естественного отбора изменение частот аллелей и генотипов. Гормоны щитовидной железы тироксин трийодтиронин В состав гормонов щитовидной железы непременно входит йод и амнокислота тирозин ежедневно составе гормонов выделяется 0, 3 мг йода, следовательно человек должен ежедневно с пищей и водой получа. Гипофункция щитовидной железы гипотериоз Причиной гипотерозов является хронический дефицит йода пище и воде Недостаток секреции гормонов компенсируется за счёт разрастания ткани железы и значительное увеличение её объёма. Эстрадиол Функции 1 Развитие женских половых органов яйцеводов, матки, влагалища, молочных желёз 2 Формирование вторичных половых признаков женского пола телосложение, фигура, отложение жира Железы внутренней секреции эндокринная система и их гормоны Эндокринные железы Гормоны Функции Гипофиз передняя доля аденогипофиз средняя доля задня. I Рефлекторная функция 1 Защитные рефлексы кашель, чихание, мигание, рвота, слёзоотделение 2 Пищевые рефлексы сосание, глотание, сокоотделение пищеварительных желёз, моторика и перистальтика.

Конечный мозг большой мозг, большие полушария переднего мозга 1 В процессе эмбриогенеза развивается из первого мозгового пузыря нервной трубки зародыша 2 Состоит из двух полушарий правого и левого, разделённых глубокой продольной щелью и соединён. Функции ассоциативных зон 1 Связь между различными зонами коры сенсорными и моторными 2 Объединение интеграция всей чувствительной информации, поступающей кору с памятью и эмоциями 3 Решающее. Функции вегетативной нервной системы Большинство органов тела иннервирует как симпатическая, так и парасимпатическая системы двойная иннервация Оба отдела оказывают на органы три рода действий сосудодвигательное. Особенности признаки безусловных и условных рефлексов Безусловные рефлексы Условные рефлексы 1 Врожденные видовые реакции организма передаются по наследству генетически детерм. Методика выработки образования условных рефлексов Разработана И П Павловым на собаках при изучении слюноотделения при действии световых или звуковых раздражений, запахов, прикосновений и проток слюнной железы выводился наружу через разр. Функционирование глаза Зрительная рецепция начинается с фотохимических реакций, начинающихся палочках и колбочках сетчатки и заключающихся распаде зрительных пигментов под действием квантов света Именно. Биосферный 6 7 8 12 1 Представлен клеточными органоидами 2 Биологические мезосистемы 3 Возможны мутации 4 Гистологический метод исследования 5 Начало метаболизма.

Экзаменационное цифровое тестирование по теме Метаболизм клетки Энергетический обмен Фотосинтез Биосинтез белка 1 Осуществляется у автотрофов 52 Осуществляется транскрипция 2 Связан с функционировани. Основы биотехнологии культивирование изолированных клеток и тканей растений Учебнометодическое пособие Часть. Несмотря на многообразие работ этом направлении, них все же наметились общие приемы, лежащие основе криосохранения обработка клеток перед замораживанием, применение криопротекторов, соблюдение определенного режима замораживания интервале от 0 до 40 С редких случаях до 70 С, а также специальные предосторожности при оттаивании объектов. Большое значение при криосохранении имеет правильно подобранный режим замораживания от 0 до 40 С Как правило, для всех объектов устанавливается скорость замораживания 0, 51 С минуту и всю эту работу проводят на специальном оборудовании, обеспечивающем программное замораживание Такие приборы выпускает специальное конструкторское технологическое бюро с опытным производством при Институте проблем криобиологии и криомедицины Харьков. Генетическая природа и механизм возникновения сомаклональной изменчивости пока мало изучены Однако четко можно выделить зависимость возникновения сомаклональных вариантов, прежде всего, от генетической гетерогенности соматических клеток исходного экспланта, генетической и эпигенетической изменчивости, индуцируемой условиями культивирования in vitro, а также от генотипа и исходного экспланта.

Высокая степень разнообразия сомаклонов зависит от исходного генотипа, природы и стадии развития экспланта Например, у различных злаков степень изменчивости среди сомаклонов может значительно различаться у пшеницы 2n 6х 42 из 192 исследованных растенийрегенерантов 29 были анеуплоидами, у гексаплоидного овса 2n 6х 42 выявлены цитогенетические изменения с такой же частотой, а для кукурузы частота возникновения анеуплоидных растений не превышала 23 Образование полиплоидных и анеуплоидных растений может наблюдаться и у других видов, например, на картофеле Причем частота появления новых вариантов у диких видов значительно ниже, чем у дигаплоидных линий культивируемого картофеля.

Условия культивирования и, частности, нарушение гормонального баланса питательной среды одна из причин возникновения генетического разнообразия культивируемых клеток вследствие нарушения клеточного цикла, частности митоза От соотношения фитогормонов, входящих состав питательных сред, во многом зависит цитогенетическая структура клеточных популяций Однако морфологическая и цитогенетическая разнокачественность клеточных популяций может возникнуть и вследствие влияния отдельных компонентов питательной среды некоторых минеральных солей, сахарозы или другого источника углеродного питания, витаминов, растительных экстрактов, а также от режима выращивания Длительное культивирование клеток in vitro также способствует повышению генетического разнообразия сомаклонов Причем для некоторых видов показано, что, несмотря на присутствие культуре клеток разной плоидности, регенерировавшие растения были преимущественно диплоидными Это явление было объяснено тем, что процессе культивгирования отбирались растениярегенеранты с более или менее нормальной морфологией, которые регенерировали, как правило, первую очередь.

Различные типы морфогенеза соматический эмбриогенез или органогенезтакже могут поразному сказываться на генетических изменениях и, соответственно, на фенотипе растений Экспериментально установлено, что при соматическом эмбриогенезе время прохождения цикла клетка растение значительно короче, чем при органогенезе, поэтому степень сходства получаемого материала и исходного родительского генотипа может быть значительно выше.

Получение стабильно устойчивых линий процесс длительный Как правило, селекция начинается с получения достаточного количества каллусной массы из изолированных растительных эксплантов, использующейся дальнейшем для определения концентрации селективного фактора построение дозовой кривой, при которой наблюдается одновременно рост каллусной ткани, и то же время часть каллусных колоний погибает Выбранная концентрация селективного фактора признается оптимальной и используется дальнейших экспериментах Так как первично полученные на средах с селективными факторами колонии клеток могли возникнуть вследствие физиологической адаптации или определенного состояния дифференцировки клеток и не быть генетически устойчивыми, то течение последующих 46 субкультивирований на селективной среде проверяется стабильность устойчивости полученных клонов Затем их переносят на среду без селективного фактора и субкультивируют еще 23 пассажа И только после повторного возвращения селективные условия отбирают стабильные клоны, из которых пытаются получить растениярегенеранты Однако работы, проведенные с получением растений, устойчивых к повышенным солям, а также к токсинам, выделенным из грибоввозбудителей болезней, показали, что устойчивость клетки и растения к исследуемому селективному фактору может совпадать и не совпадать Прямая корреляция между устойчивостью растений и клеток in vitro отмечена лишь для низких температур, устойчивостью к гербицидам, высоким концентрациям алюминия и другим факторам.

Большое число работ по культивированию каллуса, с целью получения нового селекционного материала, проведено на пшенице, ячмене, рисе, сорго, а также на картофеле, томатах, люцерне и, крайне редко, на древесных Уже достигнуты первые положительные результаты по получению растений пшеницы, риса, картофеля, устойчивых к NaCl или Na2S04 Получены клетки, а из них растения моркови, которые синтезируют 20 раз больше метионина, 30 раз триптофана, 5 раз лизина путем добавления питательную среду токсичных аналогов аминокислот Для картофеля получены растения, устойчивые к кольцевой гнили Что касается древесных, то для них работы этом направлении крайне редки и часто имеют поисковый характер Таким образом, использование каллусной культуры селекционных целях открывает огромные возможности создании новых форм растений, несущих ценные признаки, необходимые для человечества.

Под методом физиологической комплементации, который также используется для обнаружения соматических гибридов, подразумевают способность гибридных клеток жить и размножаться либо переходить к морфогенезу условиях культуры, при которых родительские клетки этого делать не состоянии, причем неспособность родительских клеток не связана с какойнибудь определенной мутацией, а является нормальной физиологической реакцией клетки на физиологические условия Например, половые гибриды между N glauca и N Langsdorfii имеют склонность к опухолеобразованию, а клетки гибридов условиях in vitro способны расти и размножаться на питательных средах без гормонов Гормононезависимость клеток гибрида и была положена основу метода селекции После индуцированного слияния протопластов из мезофилла листьев обоих видов табака клетки через некоторое время пересаживали на питательную среду, не содержащую фитогормонов, и отбирали колонии, способные расти этих условиях Существуют также другие методы селекции соматических гибридов смешанная физиологогенетическая комплементация, физическое обогащение метод основан на разделении протопластов при центрифугировании связи с их различной плотностью, механическая изоляция.

Условия культивирования и, частности, нарушение гормонального баланса питательной среды одна из причин возникновения генетического разнообразия культивируемых клеток вследствие нарушения клеточного цикла, частности митоза От соотношения фитогормонов, входящих состав питательных сред, во многом зависит цитогенетическая структура клеточных популяций Однако морфологическая и цитогенетическая разнокачественность клеточных популяций может возникнуть и вследствие влияния отдельных компонентов питательной среды некоторых минеральных солей, сахарозы или другого источника углеродного питания, витаминов, растительных экстрактов, а также от режима выращивания Длительное культивирование клеток in vitro также способствует повышению генетического разнообразия сомаклонов Причем для некоторых видов показано, что, несмотря на присутствие культуре клеток разной плоидности, регенерировавшие растения были преимущественно диплоидными Это явление было объяснено тем, что процессе культивгирования отбирались растениярегенеранты с более или менее нормальной морфологией, которые регенерировали, как правило, первую очередь.

Селекция растений на клеточном уровне Значительный интерес представляет вопрос об использовании клеточной селекции комплексе с получением сомаклонов Одна из наиболее сильных сторон культуры in vitro создании технологий для сельского хозяйства возможность на основе сомаклональных вариаций или индуцированных мутаций отбирать жестких селективных условиях клетки, характеризующиеся искомыми признаками. Главная Архитектура Астрономия Банковское биржевое дело и страхование Безопасность жизнедеятельности Биология и естествознание Биржевое дело Ботаника и сельское хозво Военное дело Генетика География и экономическая география Геология Геология гидрология и геодезия Государственноправовые Зоология История История и исторические личности Компьютерные сети интернет Кулинария и продукты питания Москвоведение краеведение Музыка Педагогика Психология Экономика туризма. II этап 1902 1922 гг ознаменовался созданием первых питательных сред для культивирования тканей животных Эти среды были природного происхождения и содержали, как правило, плазму крови и зародышевую жидкость Попытки вырастить изолированные растительные ткани на искусственных питательных средах содержащих растительные экстракты, оказались неудачными, так как экспериментах использовались мало подходящие для проявления ростовой активности клетки и ткани высших растений.

В последние 15 лет области клеточной инженерии растительной клетки выделилось направление по созданию новых клеток и клеточных систем путем введения микроорганизмов клетку или популяции культивируемых клеток растений Экспериментально создаваемые клеточные системы называют ассоциациями по аналогии с ассоциациями, формирующимися природе между организмами разных видов При этом исследования направлены на получение ассоциаций внутриклеточного эндосим биотического или межклеточного экзосимбиотического типа В первом случае проводят индуцированное введение микроорганизмов изолированные протопласты высших растений Во втором совместно культивируют клетки или ткани растений с микроорганизмами Хотя, как будет видно при дальнейшем изложении, исходно задаваемая эксперименте локализация микроорганизмов внутри клеток или межклетниках тканей не всегда сохраняется процессе создания и культивирования таких систем.

Органы, ткани, суспензии растительных клеток, протопластов культивируют на питательных средах твердых агаровых или жидких, включающих макро и микроэлементы минерального питания, сахара чаще сахароза или глюкоза, витамины, аминокислоты или гидролизат казеина фитогормоны цитокииины, ауксины, гиббереллины и биологически активные вещества Все живые, изолированные клетки и ткани разных органов растений стебля, корня, листа, стеблевой меристемы частей цветка покрытосемянных, гаметофитов голосемянных и споровых растений при определенных условиях культивирования образуют каллусную ткань состоящую из дедифференцированных клеток Изменяя условия культивирования каллусной ткани, можно вызвать дифференциацию клеток, образование регенерационных меристем и восстановление целогорастения рис 70.

В 1949 было выяснено, что клетки меристематических тканей растений обычно не содержат вирусов В 1952 Дж Мораль и Г Мартин предложили, используя культивирование меристем, получать здоровые, избавленные от вирусной инфекции растения Они обнаружили, что при выращивании верхушки побега, состоящей из конуса нарастания и 2 3 листовых зачатков, на ней образуются сферические образования протокормы Протокормы можно делить, и каждую часть культивировать до образования корней и листовых примордиев, получая большом количестве генетически однородные безвирусные растения В настоящий момент культивирование меристем побега наиболее эффективный способ оздоровления растительного материала от вирусов, вироидов и микоплазм Однако при этом способе требуется соблюдать определенные правила Как уже говорилось, чем меньше размер меристематического экспланта, тем труднее вызвать нем морфогенез.

Большое число работ по культивированию каллуса, с целью получения нового селекционного материала, проведено на пшенице, ячмене, рисе, сорго, а также на картофеле, томатах, люцерне и, крайне редко, на древесных Уже достигнуты первые положительные результаты по получению растений пшеницы, риса, картофеля, устойчивых к NaCl или Na2 S04 Получены клетки, а из них растения моркови, которые синтезируют 20 раз больше метионина, 30 раз триптофана, 5 раз лизина путем добавления питательную среду токсичных аналогов аминокислот Для картофеля получены растения, устойчивые к кольцевой гнили Что касается древесных, то для них работы этом направлении крайне редки и часто имеют поисковый характер Таким образом, использование каллусной культуры селекционных целях открывает огромные возможности создании новых форм растений, несущих ценные признаки, необходимые для человечества. Пипеткой отобрать 5 мл верхней фракции суспензии верхнем слое суспензии преобладает фракция одиночных клеток и смешать с 5 мл агаризированной 1, 4 агара среды для культивирования каллуса Работу проводить стерильной посуде мерном цилиндре, стакане. Работа 1 Индукция органогенеза и соматического эмбриогенеза каллусной ткани табака под действием фитогормонов.

В 1955 Скуг и Миллер предложили гипотезу гормональной регуляции культуре клеток и тканей, которая сейчас известна, как правило СкугаМиллера если концентрация ауксинов и цитокининов питательной среде относительно равны или концентрация ауксинов незначительно превосходит концентрацию цитокининов, то образуется каллус если концентрация ауксинов значительно превосходит концентрацию цитокининов, то формируются корни если концентрация ауксинов значительно меньше концентрации цитокининов, то образуются почки, побеги. Объяснение Гаплоидия является таким уменьшением числа хромосом, при котором половинном наборе соматической и половой клеток каждая пара гомологичных хромосом представлена лишь одной из них Гаплоидом или моноплоидом называют организм, имеющий соматических клетках гаплоидный набор негомологичных хромосом Генотип гаплоидов имеет характерные особенности У гаплоидов проявляются рецессивные гены Гаплоиды по внешнему виду сходны с соответствующими диплоидами, но меньше их Клетки гаплоидов имеют меньший размер, чем клетки диплоидов Гаплоиды не образуют полноценных гамет Путем удвоения числа хромосом соматических клеток гаплоида можно получить полностью гомозиготное диплоидное растение.

В процессе культивирования изолированных пыльников на питательных средах развитие идет двумя путями либо прямым андрогенезом образованием эмбриоидов и гаплоидных растенийрегенерантов, либо косвенным андрогенезом, когда репродуктивные клетки дедифференцируются и переходят к пролиферации, образуя сначала каллус, а затем при пассировании на специальные среды морфогенный каллус и регенеранты. Культура меристем in vitro асептическое выращивание на искусственной питательной среде изолированного апекса или пазушной почки побега конуса нарастания с одним или двумя листовыми примордиями. Меристема образовательная ткань с мелкими, активно делящимися клетками. Клональное микроразмножение или микроклональное размножение получение in vitro неполовым путем растений, генетически идентичных исходному метод вегетативного размножения растений культуре in. Редифференциация переход специализированных клеток из одного состояния дифференцировки другое с предшествующими делениями или непосредственно. Морфогенез in vitro процесс формообразования, то есть заложения, роста и развития клеток цитогенез, тканей гистогенез и органов органогенез культуре клеток и тканей in. Субкультивирование процесс переноса транспланта или инокулюма культуральный сосуд на свежую питательную среду. Штамм культура, возникшая после первого субкультивирования, и состоящая из многих клеточных линий, возникших из клеток первичного каллуса.

Линия культура, возникшая из штамма путем селекции или клонирования, имеющая маркерные признаки. Можно назвать несколько направлений создания современных технологий на основе культивируемых клеток растений 1 Получение биологически активных веществ растительного происхождения традиционных продуктов вторичного метаболизма токсинов, гербицидов, регуляторов роста, алкалоидов, стероидов, терпеноидов, имеющих медицинское применение новых необычных соединений, что возможно благодаря исходной неоднородности клеточной популяции, генетической изменчивости культивируемых клеток и селективному отбору клеточных линий со стойкими модификациями, а некоторых случаях и направленному мутагенезу Кроме того, суспензионные культуры могут применяться как мультиферментные системы, способные к широкому спектру биотрансформаций химических веществ В результате биотрансформации получают уникальные биологически активные продукты на основе синтетических соединений или веществ промежуточного обмена растений.

Процесс перехода к каллусному росту начинается с остановки клеточных делений Лагфаза продолжается 24 48 часов, течение которых клетки увеличиваются размерах и ткань экспланта разрыхляется Далее клетки начинают быстро делиться, образуя каллусную ткань В каллусных клетках появляются специфические белки и одновременно исчезают белки, характерные для фотосинтезирующих клеток В клетках каллусной ткани происходят не только биохимические, но и цитологические изменения Через 6 12 часов после индукции дедифференцировки клеточная стенка разрыхляется и набухает, увеличивается число свободных рибосом, элементов аппарата Гольджи, а также изменяются число и размеры ядрышек Все это предшествует началу процессов деления, которые начинаются через 48 72 часа. Первичный каллус, возникший на эксплантах через 4 6 недель зависимости от скорости роста клеток, для того, чтобы не произошло старения, утраты способности к делению и дальнейшему росту, а также отмирания каллусных клеток, переносится на свежую питательную среду пассируется или субкультивируется Размер транспланта переносимого фрагмента при культивировании на агаризованной питательной среде обычно составляет от 60 до 100 мг массы ткани на 30 40 мл питательной среды В процессе субкультивирования формируется штамм, характеризующийся индивидуальными генетическими и физиологическими особенно стями.

Обычно для получения суспензионной культуры используются рыхлые обводненные каллусные ткани Оптимальными подходами для получения суспензии являются выращивание каллусов на среде с 2, 4 Д, исключение из среды ионов кальция, обработка пектиназой транспланта, предназначенного для выращивания суспензионной культуре. По степени агрегированности выделяют мелкоагрегированную культуру 40 одиночные клетки, 60 мелкие агрегаты среднеагрегированную культуру 40 одиночные клетки, 40 мелкие агрегаты, 20 крупные агрегаты крупноагрегированную культуру 40 мелкие агрегаты, 60 крупные агрегаты. Впервые подобрать условия, подходящие для деления отдельных клеток, удалось 1954 году Мьюиру, Хильденбрандту и Райкеру Этот способ получил название метода ткани няньки При этом клетку изолируют из рыхлого каллуса непосредственно на кусочек фильтра, помещенный за 2 3 дня до изолирования на верхушку каллусной ткани, из которой была взята клетка В качестве няньки можно также использовать каллусную ткань другого растения родственного вида В любом случае каллус должен находиться фазе активного роста Только тогда клетки способны расти и делиться По мере старения каллусаняньки фильтр с клетками переносится на молодой каллус При достижении колонией, выросшей из отдельной клетки, размера 0, 5 1 мм, она может быть перенесена для дальнейшего выращивания на агаризованную питательную среду непосредственно либо на фильтр, помещенный на поверхность питательного агара.

Метод микрокамеры был разработан Джонсом 1960 и может быть использован при оптимальной сбалансированности состава питательной среды для культивирования отдельной клетки Метод включает следующие процедуры на предметное стекло с помощью жидкого парафина на небольшом расстоянии наклеивают покровные стекла между которыми наносят квадрат из жидкого парафина камеру из парафина помещают каплю питательной среды с отдельной клеткой сверху камеру накрывают еще одним покровным стеклом за развитием клеточной колонии наблюдают под микроскопом Использование микрокамеры Джонса позволило Вэсилу и Хильдебрандту 1965 продемонстрировать возможность получения из изолированной клетки табака нормально развивающегося и достигшего цветения растения Таким образом, впервые экспериментально была доказана тотипотентность клетки растения. Для получения каллусных тканей фрагменты органов помещают на питательные среды in vitro Процесс получения и поддержания каллуса требует стерильных условий Клетки тканей, помещенных на искусственные среды, дифференцируются, теряют функции, которые они выполняли растении, и начинают делиться, что приводит к формированию каллуса. Агарагар предварительно замачивают воде для набухания Затем его нагревают на электроплитке при помешивании до полного растворения После этого раствор агара надо слить с раствором солей, витаминов и сахарозы и довести объем среды до 1л Колбы со средой закрывают ватной пробкой, бумагой или фольгой и стерилизуют автоклаве.

Одно из основных условий успешного культивирования изолированных органов, тканей, клеток и протопластов состоит соблюдении строгой стерильности 1 Тщательная стерилизация необходима, так как на искусственных питательных средах, предназначенных для культивирования растительных тканей и клеток хорошо развиваются и микроорганизмы, что создает опасность дял культивируемого материала В результате жизнедеятельности организмов изменяется состав питательных сред Кроме того, изолированные от растения ткани, клетки и особенно протопласты легко повреждаются микроорганизмами Поэтому все опыты с культурой изолированных органов, тканей, клеток и протопластов растений проводят ламинарбоксах Стерилизуют бокс, инструменты, посуду, растительный материал, питательные среды, ватные пробки и все другие материалы, необходимые для работы. Еще более строгой стерилизации можно добиться под давлением автоклаве, так как влажный жар эффективнее убивает микроорганизмы и их споры, чем сухой Автоклавированию подвергают стаканы с крышками, чашки Петри, пипетки, колбы с дистиллированной водой Посуду заворачивают фольгу или оберточную бумагу и автоклавируют при 2 атм В течение 2530 минут Верхнюю часть градуированных пипеток закрывают ватной прокладкой, пипетки заворачивают бкмагу по 10 штук.

Инструменты Предварительную стерилизацию инструментов скальпелей, пинцетов, игл и проводят нагреванием сухим горячим жаром сушильном шкафу течение 12 при 140 о С Кипячением удобно стерилизовать шприцы Металлические предметы нельзя стерилизовать автоклавированием, так как под действием пара они ржавеют и тупятся Непосредственно перед работой и процессе посадки инструменты стерилизуют дополнительно, помещая фарфоровый стакан с 96 ным этиловым спиртом и обжигая пламени спиртовки Обжигать можно ланцеты, пинцеты, микробиологические петли После стерилизации обжиганием каждый инструмент помещают между листами предварительно простерилизованной плотной бумаги, сложенными пачку или специальный штатив Стерильный инструмент используют только для одноразовой манипуляции Затем его следует снова простерилизовать спиртом и обжечь Очень тонкие инструменты иглы, кусочки лезвий могут терять свои свойства при обжигании, поэтому их стерилизуют, погружая спирт. Одно из направлений клеточных технологий это использование их селекции которое облегчает и ускоряет традиционный селекционный процесс создании новых форм и сортов растений Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей invitro условно можно разделить на две группы.

Метод эмбриокультуры находит все более широкое применение межвидовой гибридизации овощных растений Для лука разработаны приемы выращивания invitro абортивных зародышей от гибридных семян с разных этапов эмбриогенеза выращивание зародышей от частично фертильных межвидовых гибридов Культура изолированных зародышей используется селекции томатов и других овощных растений. Культура изолированных зародышей как вспомогательный метод при отдаленной гибридизации применяется не только для преодоления постгамной несовместимости но также с целью микроразмножения ценных гибридов В этом случае микроразмножение идет путем каллусогенеза индукции морфогенеза и получения растенийрегенерантов из каллусной ткани Техника клонирования незрелых зародышей позволяет размножать ценные генотипы растений на ранних стадиях жизненного цикла Еще одна возможность применения культуры зародышей использование ее клеточной селекции. Гаплоиды полученные invitro могут применяться не только практической селекции но и работах по генетической инженерии а также по клеточной селекции Пыльцевые зерна являются некоторых случаях более удобными чем протопласты объектами для опытов по генетической трансформации.

Для определения жизнеспособности клеток после оттаивания применяют наиболее простой быстрый и вполне удовлетворительный способ окраска витальным красителем 0 1 ным феносафранином или 0 25 ным раствором сини Эванса результате которой мертвые клетки окрашиваются а живые нет Окончательным критерием безусловно служит четкое возобновление роста и деления клеток при рекультивации на искусственных питательных средах после оттаивания. Сомаклональная вариабельность Метод культуры изолированных клеток тканей и органов растений invitro широко используемый для решения многих фундаментальных вопросов клеточной биологии физиологии и генетики растений настоящее время находит все большее применение и при создании новых биотехнологий Начиная с первых работ по культивированию растительных клеток тканей и органов особый интерес у исследователей вызвал вопрос о том какие клеточные изменения могут происходить изолированных клетках растущих на искусственных питательных средах и причины их вызывающие С разработкой техники получения растенийрегенерантов из каллусной ткани появилась возможность получать новые формы растений отличающиеся как по фенотипическим так и по генетическим признакам от исходных растений Такое разнообразие среди клеточных линий и растенийрегенерантов получило название сомаклоны хотя еще 70 80е годы нашего столетия было принято называть растения регенерировавшие из каллусной ткани калликлонами а из протопластов протоклонами.

Учебник рекомендован для общеобразовательных учреждений вида лицей Содержание представлено логике Новой концепции биологического образования, которое раскрывается через изучение основ общей биологии 6 классе. Гибридо ма гибридная клеточная линия, полученная результате слияния клеток двух видов способных к образованию антител Bлимфоцитов, полученных из селезёнки иммунизированного животного чаще всего мыши, и раковых клеток миеломы Слияние клеток производится с помощью нарушающего мембраны агента, такого, как полиэтиленгликоль или вирус Сёндай. Углеводы обширный наиболее распространенный на Земле класс органических соединений, входящих состав всех организмов и необходимых для жизнедеятельности человека и животных, растений. Реферат на тему Методы и условия культивирования изолированных клеток и тканей растений.

Сомаклональная вариабельность Метод культуры изолированных клеток, тканей и органов растений in vitro широко используемый для решения многих фундаментальных вопросов клеточной биологии, физиологии и генетики растений, настоящее время находит все большее применение и при создании новых биотехнологий Начиная с первых работ по культивированию растительных клеток, тканей и органов особый интерес у исследователей вызвал вопрос о том, какие клеточные изменения могут происходить изолированных клетках, растущих на искусственных питательных средах, и причины, их вызывающие С разработкой техники получения растенийрегенерантов из каллусной ткани появилась возможность получать новые формы растений, отличающиеся как по фенотипическим, так и по генетическим признакам от исходных растений Такое разнообразие среди клеточных линий и растенийрегенерантов получило название сомаклоны, хотя еще 70 80е годы нашего столетия было принято называть растения, регенерировавшие из каллусной ткани, калликлонами, а из протопластов протоклонами.

Цитологические исследования показали, что вариабельность, индуцируемая условиями культивирования in vitro связана с генетическими изменениями Прежде всего одним из основных источников появления фенотипических вариантов являются различные кариологические изменения и перестройки Однако выявить, какие из них будут иметь фенотипический эффект и наследоваться как стабильная мутация генов, часто сложно Как грубые, так и тонкие хромосомные изменения мелкие деления, дупликации, транслокации, инверсии могут вызвать существенные фенотипические изменения как растенияхрегенерантах, так и последующем потомстве Хромосомные изменения часто наблюдаются при мейозе Анализ мейоза клетки регенерантах показал такие интенсивные перестройки хромосом, как транслокация, инверсия, субхроматидный обмен, частичная утрата хромосом Это является доказательством того, что большая часть фенотипических изменений обусловлена генетическими механизмами. Метод культивирования изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах стерильных условиях in vitro получил название культуры изолированных тканей сортов растений Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей. Культивирование отдельных клеток Методы изолирования одиночных клеток Методы выращивания in vitro одиночных клеток метод культуры няньки, метод плейтинга, метод микрокультуры Фактор кондиционирования Значение культуры отдельных клеток для доказательства тотипотентности растительной клетки.

Молекулярнофизиологические основы процесса дифференциации Основные типы дифференцировки Гистогенез культуре in vitro Физиологические аспекты стимуляции флоэмо и ксилемогенеза Морфогенез in vitro Прямой и непрямой морфогенез Морфофизиологическая характеристика ризогенеза, флорального и стеблевого органогенеза Факторы, определяющие возможность и направленность процесса органогенеза. Cостав Молярность Концентрация Объем храня Условия кислота 3 Дистиллированной водой доводят объем до 950. Стерилизация посуды Вначале посуду тщательно моют с использованием детергентов либо раствора двухромовокислого калия серной кислоте Вымытую посуду ополаскивают дистиллированной водой и высушивают сушильном шкафу Чтобы избежать заражения простерилизованных предметов из воздуха, перед стерилизацией их заворачивают оберточную бумагу у стаканов и колб достаточно обернуть алюминиевой фольгой только горлышко Затем посуду помещают сушильный шкаф и прогревают при 160 С течение 2 с момента установки нужной температуры За это время погибают не только бактерии, но и их споры Еще более строгой стерилизации можно добиться под давлением автоклаве, поскольку влажный жар более губителен для микроорганизмов и спор Автоклавирование проводят под давлением 2 атм течение 2530. Стерилизация растительного материала Процесс получения стерильного растительного материала свободного от эпифитных и ризосферных микроорганизмов состоит из нескольких этапов.

При работе со стерильной посудой и материалом необходимо помнить о том, что нельзя проносить руки над открытой стерильной поверхностью Колбы и другие сосуды, закрытые крышками из фольги и бумаги, необходимо открывать следующим образом бумагу снимают до внесения колбы ламинарбокс Фольгу обжигают, пронося горло сосуда над пламенем спиртовки, затем осторожно разворачивают края фольги с помощью стерильного пинцета и снимают ее Закончив работу, закрывают сосуд обжигают горло сосуда, стерильным пинцетом берут крышку из фольги, обжигают с двух сторон и закрывают горло колбы Когда фольга остынет, прижимают ее плотно к горлу сосуда После этого сосуд можно вынести из ламинарбокса, сверху покрыть фольгу бумагой. Для этого необходимо определить массу каллусов конце цикла выращивания На основании имеющихся данных о начальной и конечной массе каллусных тканей произвести расчет индекса роста, удельной скорости роста и времени удвоения биомассы Результаты оформить виде таблицы. Цель работы освоить технику инициирования суспензионной культуры из каллусной ткани рыхлого типа и произвести субкультивирование клеточной суспензии на свежую питательную среду. Сделать вывод о влиянии фитогормонов на направление морфогенеза культуре клеток табака, а также морфогенетической способности каллусных тканей зависимости от продолжительности культивирования. Б стимулирует процессы получения гаплоидных растений путем андрогенеза и гиногенеза.

В повышение генетической гетерогенности результате мутагенного воздействия регуляторов роста. Е длительное субкультивирование, приводящее к накоплению популяции генетически измененных клеток и клонов. А из листьев, вычлененных из зрелых растений эчеверии, развиваются только стеблевые почки. Б с увеличением продолжительности культивирования тканей утрачивается их способность к регенерации стеблевых и цветочных почек. В из сегментов стебля, изолированных из базальной части, формируются вегетативные почки. Д индукция возникновения адвентивных побегов каллусной 5 Что из перечисленного не относится к преимуществам соматического эмбриогенеза как одного из способов микроклонального размножения растений. В возможность существенного ускорения процесса создания новых сортов растений. Большая заслуга деле pa зработки методов культивирования тканей принадлежит Каррелю Он впервые доказал возможность размножения клеток животных искусственных условиях и тем самым продемонстрировал их бессмертность и сходство с одноклеточными свободноживущими организмами Значительных успехов этом направлении достигла группа исследователей под руководством Эрла Они первые получили рост большого числа клеток на стекле и жидкой перемешиваемой суспензии Появление антибиотиков и успехи создании искусственных питательных сред открыли новую эру развитии методов тканевых культур.

Различают линии и штаммы перевиваемых клеток Первым термином обозначают перевиваемые клетки, характеризующиеся потенциальным бессмертием и, как правило, гетероплоидным кариотипом вторым термином полуперевиваемые клетки с диплоидным набором хромосом и ограниченной продолжительностью жизни in vitro Появление и тех, и других клеток связано с процессом отбора клеточной популяции первичных культур, являющихся, таким образом, источником всех линий и штаммов перевиваемых клеток. Способность перевиваемых клеток к бесконечному размножению in vitro знаменует собой качественный скачок, результате которого клетки приобретают способность к автономному существованию, подобно микроорганизмам, выращиваемым на искусственных питательных средах Совокупность изменений, приводящих к появлению у клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур трансформированными. Особую категорию клеточных культур составляют полуперевиваемые штаммы, имеющие диплоидный набор хромосом Они выгодно сочетают себе черты первичных и перевиваемых клеток. В качестве примера питательной среды, полностью состоящей из естественных компонентов, можно назвать среду Бакли, предложенную для выращивания клеточных культур из почечного эпителия обезьян В эту среду входит коровья амниотическая жидкость 85, лошадиная сыворотка 10 и коровий эмбриональный экстракт.

Раствор 1 В 500 мл воды, нагретой приблизительно до 80, помешивая, растворяют указанные выше количества аминокислот, после чего добавляют лглютамин и фенолкрасный. Раствор 3 В 200, 0 мл воды растворяют все витамины, кроме биотина и птероилглютаминовой кислоты, и антибиотики пенициллин и стрептомицин Все растворы стерилизуют фильтрованием через стеклянный фильтрнутч пористая стеклянная пластина, величина пор 0, 7 1, 5 либо через асбестоцеллюлозные пластины Зейтца после предварительного промывания водой, а затем приготовленным раствором. Известны такие первичные культуры, как культура фибробластов куриного эмбриона, культура клеток почки теленка, лейкоциты.

Метилцеллюлоза концентрации 0, 10, 2 обладает максимальным защитным действием на взвешенные среде клетки Протективное действие метилцеллюлозы заключается том, что молекулы образуют защитный слой вокруг клетки, предотвращающий повреждение клеток при перемешивании среды Весьма важным показателем состояния суспензионной культуры является парциальное давление кислорода жидкой фазе Концентрация кислорода газовой фазе зависит от плотности клеточной популяции и нередко бывает ниже атмосферной Недостаток кислорода ведет к появлению грануляции цитоплазмы, клетки теряют правильную округлую форму При небольшом избытке кислорода клетки имеют хорошо очерченную, правильную, округлую форму, и становятся очень крупными при повреждающем действии избытка кислорода Оптимальная концентрация кислорода для различных клеточных культур находится пределах от 9 до 17 или 293 мм рт столба При концентрации кислорода выше 20 происходит ингибиция клеточного роста Так, при концентрации кислорода 24 размножение клеток почек эмбриона кролика линия ERK снижалось наполовину, а при 30 сводилось к нулю Повышение концентрации кислорода токсически воздействует на клеточный метаболизм. Для заражения клеток и роста зараженных вирусами клеток должна использоваться специальная комната или группа комнат.

Определенные сублинии клеток HeLa например, HeLa S3 могут расти средах с низкой концентрацией ионов кальция например, CaS 2 MEM Для эффективного заражения существенно, чтобы клетки хорошо росли виде однородной суспензии Клетки осаждают низкоскоростным центрифугированием 15 мин при 900 g и ресуспендируют среде CaS 2 MEM до концентрации. Голубев Д Б Соминина А А Медведева М Н Руководство по применению клеточных культур вирусологии Л Медицина, 1976 Дьяконов Л П Глухов В Ф Поздняков А А Денисенко Г Ф Калмыкова Т П Культивирование клеток и тканей животных Ставрополь Ставроп Правда, 1988, 2 часть Животная клетка культуре под ред Л П Дьяконова, В И Ситькова. Несмотря на успехи, достигнутые области использования различных микроорганизмов, микробная биотехнология имеет целый ряд существенных недостатков Прежде всего это невозможность получения целых классов жизненно важных для человека соединений, таких как алкалоиды, стероиды, многие полифенолы и терпеноиды, поскольку природных сообществах микроорганизмов не найдены продуценты этих веществ По той же причине ограничены и возможности биотрансформационных процессов с участием микроорганизмов. Использование культур клеток и тканей как источника сырья для производства различных первичных и вторичных метаболитов имеет целый ряд преимуществ, по сравнению с традиционно используемыми источниками дикие и культурные растения и животные, живые людидоноры и органы, извлекаемые из трупов.

Существует 3 основных направления создания новых технологий на основе культивируемых клеток и тканей растений Первое из них использование результатов исследования биологии растительной клетки и методов клеточной и генной инженерии для генетического изменения клетки и получения на ее основе нового растения Второе получение ценных биологически активных веществ растительного происхождения промышленных масштабах путем культивирования клеток и тканей растений Третье использование культур клеток и тканей для быстрого микроклонального размножения и оздоровления растений. Основным типом поверхностно культивируемых растительных клеток является каллусная значительно реже культивируют клетки опухолевых тканей растений.

Классическая каллусная культура, выращиваемая поверхностным способом, первичный каллус представляет собой аморфную, рыхлую массу сильно оводненных дедифференцированных клеток, не имеющую определенной анатомической структуры, цвет которой может быть белым, желтоватым, зеленым, красным Такая рыхлая каллусная ткань легко распадается на небольшие группы клеток и кластеры и по этому может быть использована для получения суспензионной культуры Под влиянием фитогормонов клетки первичного каллуса могут претерпевать процессы вторичной обратно дифференцировки и органогенеза, что существенно сказывается на внешнем виде и консистенции плотности каллуса Так каллусная культура средней плотности уже характеризуется хорошо выра женными меристематическими очагами В ней легко инициируют ся процессы органогенеза Наконец, у плотных каллусных тканей различают зоны редуцированного камбия и трахеидоподобных элементов, которые могут дать начало целым растениям.

Культуры опухолевых клеток при глубинном и поверхностном выращивании внешне и по морфологии клеток мало отличаются от культур каллусных клеток Главным отличием опухолевых клеток является их гормональная независимость, что обеспечивает им неограниченный рост на питательных средах без добавок фитогормонов или их аналогов Кроме того, опухолевые клетки лишены способности давать начало организованным структурам, таким, как корни или побеги процессе органогенеза, не являются тотипотентными Каллусные клетки культуре иногда могут спонтанно приобретать гормононезависимость, природа которой может быть следствием мутации или результатом экспрессии генов, определяющих независимость клетки от гормонов Потеря гормонозависимости приводит к тому, что такие клетки не могут претерпевать вторичную дифференцировку, что не позволяет использовать такие клеточные культуры для получения вторичных метаболитов. Методика искусственного получения каллусной культуры у растений хорошо отработана и не вызывает затруднений Для того чтобы получить культуру ткани, из любой части растения стебель, лист, элемента цветка, корень и, вычленяют эксплантат кусочек ткани размером 0, 5 1, 0 см, стерилизуют его и помещают на питательную среду определенного состава.

Клетки животных так же способны расти либо виде суспензий, либо прикрепленными к плотному субстрату твердой поверхности Такие клетки как, HeLa клетки, происходящие из опухоли человека могут расти любом из этих состояний неограниченно долго лимфобластомные клетки растут суспендированных культурах а нормальные диплоидные клетки способны расти только будучи прикрепленными к твердой поверхности и виде монослоя монослойное культивирование Как только вся поверхность будет покрыта клетками, развитие культуры резко тормозится контактное торможение, снижается синтез целевых метаболитов и происходит перерождение или отмирание клеток Для предотвращения этих нежелательных процессов приходится периодически проводить пересев перевивку культуры на свежую питательную среду и новую поверхность При этом нормальные неопухолевые клетки могут выдерживать от 20 до 50 делений и далее подвергаются дегенерации и погибают.

Существенным диагностическим признаком культуры ткани раувольфии змеиной является наличие выделительных образований с различ ной степенью морфологической специализации клеткиидиобласты и удлиненные секреторные образования типа млечников Микрохимический и люминесцентный анализ показал, что основная масса алкалоидов на ходится этих структурных образованиях, причем максимальное со держание алкалоидов наблюдается период увеличения количества сек реторных идиобластов и образований типа млечников В растени ях рода раувольфия наивысшее содержание алкалоидов также отмечает ся аналогичных секреторных структурах идиобластах и млечниках.

В отличие от культивирования одноклеточных микроорганизмов, культивирование клеток и тканей требует для своего нормального протекания значительно более сложные по составу питательные среды Общее число компонентов может варьироваться от нескольких десятков, до нескольких сотен Помимо углеводов глюкоза, сахароза их число входят различные соли источники азота, фосфора, микроэлементов, различные аминокислоты, витамины, антибиотики для поддержания стерильности В средах для культивирования клеток растений обязательно присутствие различных фитогормонов и факторов роста Среды для культивирования клеток животных и человека требуют добавки эмбриональной сыворотки, получаемой от эмбрионов или новорожденных телят Из сыворотки выделено более 30 компонентов факторов основном белковой природы, необходимых для поддержания нормального клеточного роста, и частности прикрепления клеток к поверхности, однако вопрос о количестве и природе этих факторов до настоящего времени окончательно не решен. Подобные культуры побегов могут эффективно продуцировать ши рокий спектр вторичных продуктов, причем часто больших количе ствах, чем соответствующей культуре ткани или растении. На этапе высадки растений из пробирки почву проводят за калку растений снижают температуру выращивания до 2025 0 С, увели чивают интенсивность освещения до 510 тысяч люкс течение 1416 часов сутки, повышают влажность воздуха до 7075, создавая итоге даже атмосферу тумана.

Первая группа это вспомогательные технологии, которые не подменяют обычную селекцию, а служат ей К ним можно отнести оплодотворение in vitro преодоление программной несовместимости, культивирование семяпочек и незрелых гибридных зародышей преодоление постгамной несовместимости, получение гаплоидов путем культивирования пыльников и микроспор, криосохᴘẚʜᴇние изолированных клеток, тканей и органов, клональное микроразмножение отдаленных гибридов. Преодоление постгамной несовместимости Постгамная несовместимость при отдаленной гибридизации возникает после оплодотворения Часто при этом образуются щуплые невсхожие семена Причиной может быть расхождение во времени развития зародыша и эндосперма Изза слабого развития эндосперма зародыш бывает неспособен к нормальному прорастанию. В данном случае образовавшиеся растения не всегда бывают гаплоидными и часто отличаются по плоидности До конца не выяснено, образуются ли они от полиплоидизированных гаплоидных клеток или от слившихся клеток. Для проведения работ по клеточной селекции растений условиях in vitro качестве объекта исследования могут быть использованы каллусные, суспензионные культуры или изолированные протопласты Выбор объекта зависит от наличия разработанных технологий применительно к различным видам растений, а кроме того от конечных целей исследования.

Наряду с перечисленными выше объектами каллусная, суспензионная культура, изолированные протопласты, качестве исходного материала для селекции могут быть использованы культуры соматических или андрогенных эмбриоидов, такие органогенные экспланты, как сегменты листьев или различные меристематические и стеблевые части растений, а кроме того культура изолированных зародышей Например, путем культивирования и селекции in vitro зародышей из семян получены растения ячменя, устойчивые к аналогам аминокислот, с улучшенным содержанием белка Важно понимать для картофеля разработан эффективный метод обработки побегов и черенков мутагеном, приводивший к получению химерных мутанᴛᴏʙ хлорофиллдефектности и антибиотикоустойчивости При культивировании пыльников яровой пшеницы сорта Сараᴛᴏʙская29 и Московская35 на питательных средах с повышенным содержанием солей хлорида натрия получены соматические эмбриоиды, а дальнейшем растениярегенеранты, проявившие повышенную солеустойчивость Беккужина На основании выше сказанного приходим к выводу, что проведение селекции на клеточном уровне предоставляет возможность создавать новые формы растений 2 4 раза быстрее по сравнению с традиционными способами селекции.

В настоящее время продолжается разработка и совершенствование методов выделения и культивирования протопласᴛᴏʙ на искусственных питательных средах рис 1 15 Важно понимать для культивирования протопласᴛᴏʙ применяют те же питательные среды, что и для культуры изолированных клеток и тканей Отличительной чертой сред для протопласᴛᴏʙ является повышенное осмотическое давление на начальных этапах культивирования, которое обеспечивается высокой концентрацией маннита или СаС1. Слияние протопласᴛᴏʙ приводит к образованию либо гибрида, либо цибрида рис 1 17 Цибридная клетка содержит цитоплазму обоих партнеров, а ядро одного Это возможно том случае, если после слияния протопласᴛᴏʙ не происходит соединения ядер, и одно ядро дегенерирует Образование цибрида возможно и том случае, если один из протопласᴛᴏʙ лишен ядра или оно инактивировано путем облучения. При соматической гибридизации эксперимент строится аналогично опытам по генетике микроорганизмов Иными словами, используются большие популяции клеток обоих родителей При обработке смешанной суспензии протопласᴛᴏʙ фьюзогенами часть из них сливается друг с другом, но суспензии остаются и неслившиеся протопласты Все они, включая гибридные, вдальнейшем регенерируют клеточные стенки и переходят к делениям Возникает задача выделить из общей массы гибридные экземпляры Селекция гибридов может применяться либо на клеточном уровне, либо на стадии регенерации и осуществляется несколькими методами.

Под методом физиологической комплементации, который также используется для обнаружения соматических гибридов, подразумевают способность гибридных клеток жить и размножаться либо переходить к морфогенезу условиях культуры, при которых родительские клетки этого делать не состоянии, причем неспособность родительских клеток не связана с какойнибудь определенной мутацией, а является нормальной физиологической реакцией клетки на физиологические условия Например, половые гибриды между N glauca и N Langsdorfii имеют склонность к опухолеобразованию, а клетки гибридов условиях in vitro способны расти и размножаться на питательных средах без гормонов Гормононезависимость клеток гибрида и была положена основу метода селекции После индуцированного слияния протопласᴛᴏʙ из мезофилла листьев обоих видов табака клетки через некоторое время пересаживали на питательную среду, не содержащую фитогормонов, и отбирали колонии, способные расти этих условиях Существуют также другие методы селекции соматических гибридов смешанная физиологогенетическая комплементация, физическое обогащение метод основан на разделении протопласᴛᴏʙ при центрифугировании связи с их различной плотностью, механическая изоляция. В целом использование изолированных протопласᴛᴏʙ генетической реконструкции клетки, как мы видим, открывает богатые перспективы перед клеточной селекцией.

Перенесение клеток целостного организма условия жизни in vitro прекращает существование их как одного из многочисленных структурных элементов ткани или органа, состав которых они ранее входили При этом клетки выходят изпод контроля нейрогуморальных факторов и приобретают ряд особенностей, зависящих как от самого факта отторжения клеток от этих тканей, так и от конкретных условий их существования in vitro Живущие вне организма клетки или ткани характеризуются целым комплексом метаболических, морфологических и генетических черт, резко отличных от свойств клеток органов и тканей in vivo В зависимости от методики первичной эксплантации ткани и техники ее культивирования различают несколько видов переживающих и растущих культур тканей и клеток Наибольшее распространение имеют однослойные, а также суспензионные культуры растущих клеток Именно они составляют основу современной лабораторной и производственной вирусологической практики Различают два основных вида однослойных клеточных культур первичные и перевиваемые Термином первичная обозначают клеточную культуру, полученную непосредственно из тканей человека или животных эмбриональном или постнатальном периоде Срок жизни таких культур ограничен По прошествии определенного времени них возникают явления неспецифической дегенерации, что выражается грануляции и вакуолизации цитоплазмы, округлении клеток, утрате связи между клетками и твердым субстратом, на котором они выращивались Периодическая смена среды, изменение состава последней и другие процедуры могут лишь несколько увеличить сроки жизни первичной клеточной культуры, но не могут предотвратить ее конечной деструкции и гибели По всей вероятности, этот процесс связан с естественным угасанием метаболической активности клеток, выведенных изпод контроля нейрогуморальных факторов, действующих целостном организме Лишь отдельные клетки или группы клеток популяции на фоне дегенерации большей части клеточного пласта могут сохранить способность к росту и размножению Эти клетки, обнаружив потенцию бесконечного размножения in vitro, при многократных перевивках дают начало перевиваемым культурам клеток Различают линии и штаммы перевиваемых клеток Первым термином обозначают перевиваемые клетки, характеризующиеся потенциальным бессмертием и, как правило, гетероплоидным кариотипом вторым термином полуперевиваемые клетки с диплоидным набором хромосом и ограниченной продолжительностью жизни in vitro Появление и тех, и других клеток связано с процессом отбора клеточной популяции первичных культур, являющихся, таким образом, источником всех линий и штаммов перевиваемых клеток Основное преимущество линий перевиваемых клеток, по сравнению с любой первичной культурой, состоит потенции неограниченного размножения вне организма и относительной автономности сближающей их с бактериями и одноклеточными простейшими Способность перевиваемых клеток к бесконечному размножению in vitro знаменует собой качественный скачок, результате которого клетки приобретают способность к автономному существованию, подобно микроорганизмам, выращиваемым на искусственных питательных средах Совокупность изменений, приводящих к появлению у клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур трансформированными Особую категорию клеточных культур составляют полуперевиваемые штаммы, имеющие диплоидный набор хромосом Они выгодно сочетают себе черты первичных и перевиваемых клеток.

Первичной называется культура, полученная из ткани и выращиваемая in vitro до начала субкультивирования, то есть до первого посева Первичная культура лишена многих клеток, присутствующих исходной ткани, поскольку не все клетки способны прикрепляться к субстрату и выжить in vitro В процессе культивирования клеток происходит относительное обеднение культуры неделящимися или медленно делящимися клетками На первом этапе получения первичной культуры проводят стерильное удаление фрагмента ткани, органа животного и его механическую или ферментативную дезагрегацию Ткань измельчается до кусочков объемом до 1 3 мм, кусочки ткани отмываются от эритроцитов раствором Хенкса с антибиотиками Для дезагрегации ткани используют трипсин 0, 25 неочищенный или 0, 01 0, 05 очищенный или коллагеназу 200 2000 ед мл, неочищенная и другие протеолитические ферменты Такой способ получения культуры обеспечивает высокий выход клеток Первичные культуры могут быть также получены от кусочков ткани, объемом 1 мм, которые прикрепляются к поверхности субстрата благодаря собственной адгезивности или наличию насечек на чашке, или с помощью сгустка плазмы В этих случаях будет происходить рост клеток из фрагментов Клетки, мигрирующие из эксплантатов могут использоваться для пассирования Фрагменты ткани эксплантаты переносятся на новые чашки, мигрирующие клетки могут удаляться пересевом, смесью версена и трипсина, а остающиеся эксплантаты будут образовывать новые выросты Известны такие первичные культуры, как культура фибробластов куриного эмбриона, культура клеток почки теленка, лейкоциты.

В культуре тканей лекарственных растений можно выделить три главных направления получение недифференцированной каллусной массы, создание исходного генетического разнообразия форм растений, а также клеточную селекцию и клональное микроразмножение растений. Одна из важных особенностей культуры тканей сохранение ряде случаев способности к синтезу продуктов вторичного метаболизма, свойственных интактным растениям данного вида, алкалоидов, гликозидов, компонентов эфирных масел, стероидов. Для увеличения спектра изменчивости используют мутагенез обработка мутагенными веществами, а также селективные условия культивирования клеток Спонтанно возникшие или индуцированные мутанты популяции отбираются на устойчивость к созданным жёстким условиям высоким концентрациям солей, экстремальным температурам, гербицидам, токсинам и др В результате проведения многих экспериментов удаётся отобрать действительно устойчивые линии и получить растениярегенеранты из стабильной клеточной линии. Стеблевая меристема особенно самая её верхушка, как правило, свободна от вирусной инфекции, микоплазм и возбудителей других инфекций Поэтому клонирование клеток меристематических верхушек, а затем быстрое клональное размножение здоровых растений основа технологии получения безвирусного посадочного материала картофеля, плодовых, ягодных, декоративных и лекарственных растений. В процессе субкультивирования формируется штамм, характеризующийся индивидуальными генетическими и физиологическими особенностями.

Основными компонентами питательных сред для культуры клеток и тканей растений являются минеральные соли макро и микроэлементы, источник углеродного питания обычно сахароза или глюкоза, витамины, регуляторы роста Иногда состав питательных сред включают комплексные органические добавки гидролизат казеина или смесь аминокислот, дрожжевой экстракт, экстракты из разных органов растения Методы выращивания культуры каллусных тканей. Как правило, длительной пересадочной культуре, на средах, включающих ауксины, особенно синтетический аналог ауксина 2, 4дихлорфеноксиуксусную кислоту 2, 4Д, каллусные ткани теряют пигментацию и становятся более рыхлыми.

Форма реальных ростовых кривых может значительно отличаться продолжительностью фаз от модельной Процессы ростового цикла зависят от вида растения, количества внесенного материала и условий культивирования состав питательной среды, температура, начальное значение рН, состав газовой фазы, скорость перемешивания Первичный и вторичный метаболизм культивируемых клеток растений видоспецифичен, зависит от типа дифференцировки исходных клеток растения и регулируется условиями выращивания Генетическая изменчивость клеток как следствие их культивирования вне организма, исчезновение одних и появление других стойких признаков, передающихся ряду клеточных поколений, приводит к возникновению из первичной каллусной ткани генетически и фенотипически различающихся линий клеток Это позволяет отобрать или создать экспериментально линии, сохраняющие биосинтетические системы, характерные для исходного растения, и линии, синтезирующие принципиально новые вещества Культивирование отдельных клеток. Источником отдельных одиночных клеток являются клеточные суспензии жидкой питательной среде, мацерация тканей растений, изолированные протопласты после восстановления ими клеточной стенки Причем, изолированные протопласты являются идеальными отдельными клетками.

Для культивирования протопластов возможно использовать метод жидких капель Као К и др 1971 В этом случае суспензия протопластов виде капель жидкой среде помещается пластиковые чашки Петри Метод обеспечивает хороший газообмен через воздушную фазу и диффузию раствор экскретируемых продуктов Кроме того, легко можно добавлять свежий раствор нужной концентрации Однако при культивировании этим способом протопласты агрегируются центре каждой капли Накапливаясь, они образуют значительное количество фенольных или других токсических соединений, что препятствует дальнейшему успешному культивированию Этот метод также не удобен, если требуется исследовать развитие индивидуальной колонии протопластов. Сходным с этим методом является метод совместных культур Он используется для эффективного культивирования труднокультивируемых протопластов Такие протопласты культивируются совместно с протопластами, отличающимися быстрым ростом Успех такого культивирования основан на активных веществах, которые выделяются быстро растущими видами.

По питательным потребностям изолированные протопласты сходны с целыми клетками Поэтому питательные среды подобны таковым для клеточных культур Наиболее часто используют среды МурасигеСкуга, модифицированную среду НагатаТакебе, среду В5 ГамборгаЭвелейта, и среду 8Р КаоМичайлук, представляющую собой обогащенную витаминами, аминокислотами и сахарами среду В5 Гамборга Все эти среды содержат минеральные вещества, являющиеся источниками макро и микроэлементов, источники углерода, стабилизаторы осмотического давления, витамины, фитогормоны.

Культивирование клеток и тканей животных к настоящему времени получило широкое распространение различных областях исследований от клеточной и молекулярной биологии до быстро прогрессирующих прикладных областей биотехнологии Культуру животных тканей применяют для изучения механизмов роста и дифференцировки клеток, гистогенеза, межтканевых и межклеточных взаимодействий, обмена веществ и Культуры животных клеток являются важными продуцентами многих биологически важных веществ На них выращивают вирусы для их идентификации и получения вакцин Клеточные культуры часто применяют при тестировании и изучении механизма действия лекарственных и косметических средств, пестицидов, консервантов и Методы культуры клеток нашли широкое применение для реконструкции различных тканей и органов Так, культура клеток кожи используется для заместительной терапии при ожогах, культура клеток эндотелия для реконструкции стенок сосудов Способность клеток к росту культуре привела к развитию методов клонирования, хранения и слияния клеток, что, свою очередь, вызвало становление новой области науки генетики соматических клеток Органные культуры используются при изучении закономерностей развития органов, для изучения способов сохранения жизнеспособности изолированных органов, предназначенных для трансплантации. Главным фактором при выборе ткани или линии клеток для дальнейшего исследования является природа процесса, который будет изучаться на этих клетках.

Сегодня цитология напрямую зависит от других наук, так же как и они от. Размножение клеток происходит путем деления материнской клетки на несколько одинаковых дочерних клеток. В состав плазматической мембраны входят липопротеиды жиробелки Расположены они упорядочено и соединены друг с другом химическими связями По современным представлениям молекулы липидов плазматической мембране расположены два ряда и образуют, так называемый, билипидный слой Молекулы белков располагаются слое липидов, погружаясь него на разную глубину. Плазматическая мембрана плазмолема выполняет много важных функций, от которых завидят жизнедеятельность клеток барьерная функция, скелет клетки, который придает ей определенную структуру Одной из главных функций является транспорт веществ через мембрану Так, клетку поступают ионы гормоны аминокислоты не белки, углеводы, жиры, а выводятся продукты синтеза и продукты жизнедеятельности клетки Транспорт происходит при участии белков, изза градиента концентрации. Лейкопласты находятся цитоплазме клеток неокрашенных частей растений, например стеблях, корнях, клубнях Форма лейкопластов разнообразна. К пищевой частице, поступившей цитоплазму, подходят лизосомы, сливаются с ней, и образуется одна пищеварительная вакуоль внутри которой находится пищевая частица, окруженная ферментами лизосом Вещества, образовавшиеся результате переваривания пищевой частицы, поступают цитоплазму и используются клеткой.

Ядро Каждая клетка одноклеточных и многоклеточных животных, а также растений содержит ядро Форма и размеры ядра зависят от формы и размера клеток В большинстве клеток имеется одно ядро, и такие клетки называют одноядерными Существуют также клетки с двумя, тремя, с несколькими десятками и даже сотнями ядер Это многоядерные клетки. Ядерный сок полужидкое вещество, которое находится под ядерной оболочкой и представляет внутреннюю среду ядра. Таким образом, клетке нет какихнибудь особенных элементов, характерных только для живой природы Это указывает на связь и единство живой и неживой природы На атомном уровне различий между химическим составом органического и не органического мира нет Различия обнаруживаются на более высоком уровне организации молекулярном. Помимо способности к бесконтрольному росту еще два свойства опухолей определяют их опасность для жизни организма способность к инвазии и метастазированию. Инвазия явление прорастания опухоли нормальные ткани, нарушая их питание, функционирование, что приводит их к гибели.

Наконец, каждый из нас слышал о чудесных случаях исчезновения опухолей и выздоровления больных раком Анализ историй болезней людей, болевших стадии, когда медицина была бессильна им помочь и никакого лечения не проводилось, показывает, что очень малая доля больных по совершенно непонятным причинам выздоравливала Погибали ли опухолевые клетки организме результате изменений функционировании всего организма, превращались ли они нормальные клетки совершенно неизвестно. Трансплантация клонируемых органов способна спасти миллионы людей, умирающих по всему свету изза дефицита органов, который создается, кстати, изза всевозможных ограничений, навязанных моралистами целостность трупа и его неприкосновенность после смерти. Все системы непроточных культур характеризуются накоплением отходов той или иной форме и непостоянством внешних условий. Существует 2 крупных направления культивировании животных клеток монослойные культуры и суспензионные культуры. Когда было установлено, что кролик обладает иммунитетом по отношению к ящуру, была выдвинута идея использования метода трансплантации для оздоровления потомства зараженных ящуром животных Половые пути кролика, куда трансплантируются эмбрионы, способны разрушать вирус ящура эмбрионах Трансплантация может быть использована и для временного хранения эмбрионов В яйцеводах крольчих удается осуществлять трансконтинентальную перевозку эмбрионов овец.

Культура клеток высших растений может рассматриваться с трёх точек зрения как уникальная биологическая система, как модель физиологии растений и как инструмент для разнообразных исследований и биотехнологий Изолированные растительные клетки способны продуцировать ценные для медицины, парфюмерии и других отраслей промышленности вещества вторичного синтеза вещества не участвующие основном обмене веществ алкалоиды, стероиды, гликозиды, гормоны, эфирные масла и Продуктивность культивируемых клеток результате клеточной селекции может значительно превышать продуктивность целых растений Использование изолированных культур клеток селекции, дают возможность получать быстрорастущие растения, устойчивые к различным неблагоприятным факторам среды Вместе с тем, это направление предусматривает создание новых растений путём слияния изолированных протопластов и получение соматических гибридов Перенос изолированные протопласты чужеродных генов с помощью методов генной инженерии позволяет получать дальнейшем растения с новыми наследуемыми свойствами Культура клеток как экспериментально созданная биологическая система интересна сама по себе и является объектом исследования узкого круга специалистов Как модель, клетки in vitro представляют интерес для многих физиологов и биохимиков растений Очевидно, что адекватно использовать культуру клеток как модель можно тогда, когда чётко представляешь её свойства, как биологической системы И, наконец, как инструмент фундаментальных и прикладных исследований Статус экспериментально созданной биологической системы обусловлен свойственной культурам клеток изменчивостью, наследуемостью возникших изменений, адаптивным отбором и эволюцией В некотором роде её можно считать микропопуляцией, основное отличие которой от природных популяций это отсутствие полового размножения особей, клеток Можно выделить две принципиальные особенности культуры клеток растений как биологической системы вопервых, отсутствие организменного контроля развития, и вовторых избыточный генетический материал Культивируемые клетки и ткани могут служить адекватными моделями для исследований различных направленностей, например метаболизма и его регуляции клетках и тканях целого растения И для более глубокого понимания данных процессов и явлений часто используются методы создания биохимических мутантов, гибридных и трансформированных клеток пределах исследуемой культуры Простота клеточных моделей, возможность быстро получать достаточную массу асептических, контролируемых по многим параметрам условиях являются преимуществами такого моделирования В отношении синтеза вторичных метаболитов культуры клеток также обладают рядом достоинств, а именно возможность использования для этой цели растения, не произрастающие наших природных условиях, и получать продукцию круглый год Тем не менее, проблемы клеточных и молекулярных основ морфогенеза, не говоря уже о механизмах морфогенеза, остаются малоизученными Прежде всего, это концепция тотипотентности растительной клетки и её влияние на стратегию исследовательской работы с культурой тканей и клеток растений Постулат этой концепции о первичности внешнего сигнала морфогенетическом ответе растительной клетки во многом определил экстенсивный характер исследований области культуры клеток растений Второй причиной является сложность морфогенетических процессов, которые позволяют моделировать и изучать культуры клеток и тканей Известно, что культуре in vitro может осуществляться реализация нескольких морфогенетических программ, а именно зародышевого развития и некоторого органогенеза Возможность моделирования культуре in vitro более простых процессов, например гистогенеза и цитодифференцировок представляется затруднительнее Однако, рамках исследования эти проблемы вполне преодолимы, при индивидуальной разработке методики и постановки эксперимента.

Таким образом, ростом можно называть необратимое увеличение растения хотя бы по одному из параметров число клеток, линейные размеры, сырая сухая биомасса. По имени ученого, предложившего такую аналогию, ее называют морфогенетическим ландшафтом Уоддингтона. Идея о тотипотентности растительной клетки была выдвинута Г Хаберландтом еще 1902 хотя и не получила тогда экспериментального подтверждения Согласно определению Хаберландта, любая клетка растения может дать начало новому организму, и если этого не наблюдается, то только потому, что растительный организм подавляет потенции клетки к развитию Изоляция клеток от растений способствует проявлению этих потенций.

Обязательным условием дифференцировки растительной клетки и превращение её каллусную является присутствие питательной среде двух групп антагонистических гормонов ауксинов и цитокининов Ауксины вызывают процессы дифференцировки клетки, запуская механизмы активизации вторичных мессенджеров, способствующих растяжению клеточных стенок и дальнейшую пролиферацию, а цитокинины вызывают деление уже дифференцированных клеток Для того чтобы дифференцированные клетки вновь приобрели способность к делению, необходим возврат к меристематическому состоянию дедифференцировка Размножение дифференцированных клеток приводит к анархическому, неорганизованному росту, результате чего образуется каллусная ткань Таким образом, превращение специализированной клетки каллусную связано с индукцией митозов, способность к которому была потеряна процессе дифференцировки. В результате выхода изпод контроля организма рост каллусных клеток происходит неорганизованно, асинхронно, и является неограниченным. Клеточный цикл у каллусных клеток более длительный, чем у растений, произрастающих открытом грунте Особенностью каллусных клеток является гетерогенность по возрасту В каллусной ткани одновременно присутствуют клетки молодые G1фазе, старые G2 и Sфазах цикла клеточных делений. Существует несколько путей, по которым может идти развитие клетки после ее дедифференцировки.

Существует два основных типа морфогенеза В культуре тканей он может проявляться виде органогенеза образования монополярной структуры, отдельных органов корневого, стеблевого, реже флорального цветочного или листового, виде соматического эмбриогенеза образования биполярных зародышеподобных структур из соматических клеток. Независимость соматического эмбриогенеза от гормонов является аргументом пользу точки зрения, высказанной Хаберландтом, а позднее Стэвардом, что сам процесс изолирования клетки стимулирует реализацию ее тотипотентности, переход к морфогенезу Таким образом, основными стимулами морфогенеза являются изменения соотношения гормонов питательной среде, а также сам процесс изоляции растительной клетки от организма.

Дополнительными стимулами морфогенеза культуре каллусных тканей является присутствие питательной среде нитрата серебра, нитрата аммония, некоторых аминокислот пролин, тирозин, иногда серии, полиаминов путресцин и спермидин В ряде случаев стимулируют процесс морфогенеза маннит и сорбит Ионы N0 3 оказывают влияние на развитие возникших каллусной ткани организованных структур, а их индукцию стимулируют ионы NН 4 Гиббереллиновая кислота стимулирует рост зачатков стебля, а абсцизовая ускоряет дифференцировку органов соматических зародышей Интересно отметить, что некоторые из перечисленных веществ, например, нитрат серебра, продлевают регенерационную способность старых пересадочных культурах Под влиянием того или иного стимула морфогенеза каллусная клетка должна стать детерминированной, однако не все клетки, а лишь одна из 400 1000 становится на путь регенерации Следовательно, для перехода к морфогенезу недостаточно индуктора стимула, а необходимо, чтобы клетка была готова к ответу на него Способность воспринимать стимулы морфогенеза называют компетентностью клетки Исследователи пришли к выводу, что компетентность клеток событие случайное и поэтому столь редкое В связи с этим напрашивается вопрос о судьбе тех каллусных клеток, которые силу некомпетентности не способны воспринять стимулы морфогенеза и детерминироваться В пересадочной культуре эти клетки продолжают делиться и, скорее всего, становятся на путь перехода к гормононезависимости Однако не все каллусные ткани со временем завершают развитие возникновением гормононезависимости.

Важнейшее место изучении клеток и тканей принадлежит световой микроскопии Однако даже самые совершенные оптические микроскопы обладают относительно низкой разрешающей способностью Разрешающая способность микроскопа это наименьшее расстояние между двумя точками, при котором они видны не слитно, а раздельно Теоретически рассчитанный предел разрешающей способности оптического микроскопа составляет 1 3 длины волны используемого источника света Поскольку длина волн видимого света колеблется пределах 0, 4 0, 78 мк минимальный размер структур, которые могут быть хорошо различимы световой микроскоп, равняется 0, 2. При исследовании веществ, растворяющихся спирте, ксилоле и хлороформе, или при необходимости быстро получить препарат применяют метод резания кусочков на замораживающем микротоме Для замораживания используют обычно жидкую углекислоту или специальный морозильный столик, на который помещают кусочек ткани капле воды В результате кусочек оказывается замурованным толще льда, что позволяет получать из него срезы толщиной 10 20 мк Такие срезы могут быть сразу же подвергнуты соответствующей окраске.

Большого развития достигли методы цито и гистохимического исследования, основанные на применении специфических окрасок для выявления клетках и тканях различных химических веществ Разработаны методы, позволяющие определять активность многих десятков ферментов Они состоят выявлении с помощью окрашивания специфических продуктов ферментативных реакций Существуют многочисленные способы определения клетках и тканях неорганических элементов. Одним из достижений современной науки является исследование клеток и тканей с помощью электронного микроскопа Ход лучей оптическом и электронном микроскопах одинаков, хотя последнем вместо света используется поток электронов, исходящий из раскаленной вольфрамовой нити, помещенной вакуум, и ускоренный электрическим полем Объективу и окуляру светового микроскопа электронном соответствуют магнитные катушки, отклоняющие нужным образом мчащиеся электроны Как и ультрафиолетовом микроскопе, изображение фотографируется или просматривается на флуоресцирующем экране. Ткани теплокровных животных культивируют при температуре тела термостате Через определенный промежуток времени культуры должны пересеваться, чтобы избежать их гибели результате накопления окружающей среде токсичных продуктов жизнедеятельности При регулярном изъятии кусочков из зоны роста и перемещении их свежую питательную среду культуры практически могут поддерживаться неопределенно долго Известны культуры, которые таким способом существуют уже более полувека.

Методы, позволяющие производить прижизненно тончайшие операции на клетках и их производных, объединяются под названием микрохирургия, или микрургия Подобные вмешательства осуществляются с помощью особого прибора микроманипулятора Важнейшими его частями являются обычный оптический микроскоп и ассистенты, которые крепятся инструменты Благодаря системе винтов эти инструменты могут совершать движения различных направлениях При этом грубые движения, производимые рукой, переводятся очень тонкие и точные, за которыми следят глазом под микроскопом. Прижизненное окрашивание используют разных вариантах Кусочки тканей можно непосредственно погружать раствор того или иного малотоксичного витального красителя чаще всего нейтрального красного, а затем изучать клетки прижизненно под микроскопом Можно вводить прижизненный краситель организм, например, брюшную полость, а затем непосредственно исследовать его клетки и ткани Животному прижизненный краситель можно вводить с пищей или полость тела, кровь, а затем фиксировать различные органы и готовить из них препараты, слегка окрашивая контрастирующими красителями Витальные краски, употребляемые для этой цели, естественно, не должны растворяться жидкостями, используемыми при изготовлении препаратов Таким достоинством обладает, например, трипановая синь.

Важное значение для прижизненного исследования клеток имеют различные специальные виды микроскопии Фазовоконтрастная микроскопия позволяет обнаруживать такие структуры, которые обычный световой микроскоп не видны Принцип фазовоконтрастного устройства базируется на физической закономерности изменения фазы у лучей, проходящих через прозрачные, но отличающиеся по показателю преломления от окружающей среды объекты Запаздывание световых волн, то есть сдвиг фазы, тем больше, чем больше отличаются по показателю преломления объект и среда Возрастает сдвиг фазы и параллельно толщине объекта В фазовоконтрастном устройстве, комбинируемом с обычным оптическим микроскопом, разность фаз трансформируется разность амплитуд колебания световых волн, иначе говоря, разность интенсивности освещения, и итоге возникает контрастное изображение Оно видимо для глаза и может быть зафотографировано. Клеточные культуры насекомых имеют ряд преимуществ по сравнению с клетками млекопитающих как объект биотехнологических производств возможность культивирования при комнатной температуре, дешевизна культуральных сред, отсутствие необходимости CO2 инкубаторах, высокая плотность культуре.

В состав большинства сред входят витамины Особенно важны витамины группы В тиамин В 1, рибовлафин В 2, пиридоксин В 6 Многие культуры нуждаются также никотиновой, фолиевой, пантотеновой кислотах, мезоинозите Хотя большинство тканей культуре способно к биосинтезу витаминов, но этого количества оказывается недостаточно для выполнения метаболических функций Поэтому дополнительное внесение витаминов питательную среду стимулирует рост тканей Необходимым компонентом любой питательной среды являются фитогормоны соединения, которые участвуют регуляции физиологических процессов у растений Для роста и дифференциации растительных клеток необходимы ауксины и цитокинины Ауксины гормоны растений, производные индола Образуются апикальных меристемах и стимулируют клеточное растяжение. Солевые растворы Для культивирования клеток большин ство питательных сред готовят на сбалансированном солевом рас творе, для которого необходимы высокоочищенные препараты, так как следы ряда примесей свинец, ртуть и другие тяжелые металлы токсичны для клеток Солевые растворы готовят на бидистиллированной воде Они обеспечивают сохранение рН, осмо тического давления клетках, соответствующую концентрацию необходимых неорганических веществ Лучшими из них являют ся растворы Хенкса и Эрла Эти растворы обязательный ком понент любой питательной среды.

На занятии необходимо иметь набор солевых и прочих рас творов, питательных сред Очень хорошо демонстрировать фикси рованные препараты культур клеток или диапозитивы с после дующей их зарисовкой рабочую тетрадь. Цель занятия ознакомиться с некоторыми перевиваемыми клетками L а, С18, амниона человека и др, культурой диплоидных клеток, техникой заражения культуры клеток вируссодержащим материалом, изучить формы цитопатогенного действия. Разновидностью перевиваемых клеток являются диплоидные клетки Это морфологически однородные культуры, стабили зированные процессе культивирования in vitro, имеющие ограниченный срок жизни не более 50 пассажей, сохраняющие правильный диплоидный набор хромосом, свойственный исход ной ткани, свободные от посторонних вирусов и микробов и не обладающие онкогенной активностью. Заражение под кожу вируссодержащий материал вводят под кожу область спины Доза его для крыс 0, 5 мл, морских свинок 3 мл, белых мышей 0, 2 мл Если нужно ввести большее количество материала, то жидкость инъециру ют разные места под задний ко нец спины или различных на правлениях. Внутрикожное заражение тон кую острую иглу вводят под ост рым углом складку кожи, пред варительно освобожденную от волос В результате инъекции дол жен образоваться пузырек Доза вируссодержащего материала для всех животных 0, 1 0, 2.

Вскрытие лабораторных животных Трупы животных, павших от экспериментальной инфекции, немедленно вскрывают и проводят патологоанатомическое исследование Если зараженное животное не погибло, его убивают момент максимального и проявления симптомов болезни или, при их отсутствии, на 3 8 10 день после заражения Убить животное рекомендуется избыточной дозой наркоза, а также путем разрыва спинного мозга Для вскрытия необходимо применять только стерильные инст рументы скальпели, прямые и изогнутые ножницы, ножницы для костей, пинцеты, пастеровские пипетки Инструменты подбираются так и таком количестве, чтобы процессе вскрытия можно было часто менять Основной принцип при вскрытии к трупу животного можно прикасаться только инструментами или защищенными руками Мелких лабораторных животных мыши, крысы, морские свинки, цыплята при этом прикалывают иголками распростертом виде к доске или кювете с парафином, покрытыми клеенкой Можно, использовать специальные столики рис 49, снабженные соответствующими фиксирующими приспособлениями Они должны быть прикрыты клеенкой и установлены больших кюветах.

Перед вскрытием труп животного дезинфицируют мелких животных погружают 2, 5 ный раствор фенола на 10 15 мин, крупных опрыскивают дезраствором Вскрытие проводят со строгими соблюдением асептики и личной профилактики Разрез кожи делают по белой линии живота Кожу препарируют и оттягивают стороны Коленные складки и подмышечные ямки обнажают для исследования лимфатических узлов После этого труп животного дезинфицируют повторно, меняют инструменты и вскрывают брюшину и грудную полости Разрез делают так, чтобы не повредить желудок и кишечник Затем удаляют мышцы живота и брюшину, обнажая при этом сердце, почки, печень, селезенку и снова меняют инструменты. Взятие крови у мышей проводят после их наркоза Для этого используют поллитровую стеклянную банку с крышкой, которую кладут клочок ваты, вливают небольшое количество эфира для наркоза, помещают туда мышь и закрывают крышкой Наркоз продолжают до тех пор, пока мышь потеряет способность удерживаться на ногах Затем препаровальными иглами ее прикалывают к доске брюшком вверх, дезинфицируют поверхность живота раствором карболовой кислоты и делают продольный раз рез Отпрепаровывают кожу, создавая емкость, возле передней лопатки Стерильными глазными ножницами перерезают сосуды под лопаткой Кровь вытекает емкость, образованную складкой кожи, ее отсасывают стерильной пипеткой и переносят неболь шую пробирку Таким образом можно получить 0, 5 1 мл крови.

Вируссодержащий материал разведении, давшем эффект выше 50, обозначают буквой В, ниже 50 буквой А, процент летальности соответственно b и a Расчет производят по формуле. В качестве источника углерода для биологических макромолекул, а также при культивировании гетеротрофных тканей каллусов и суспензий питательные среды добавляют углеводы концентрации 2060 Обычно это дисахариды сахароза, моносахариды гексозы глюкоза и фруктоза, пентозы ксилоза и другие Полисахариды питательных средах практически не используются Только некоторые типы тканей опухолевые, содержащие гидролитические ферменты, выращивают на средах с крахмалом, раффинозой природный трисахарид, целлобиозой. Контроль за развитием клеток проводят с помощью прямых подсчет и непрямых методов по мутности, по подсчету ядер, по определению общего белка. Эти черенки сразу же помещают на питательную среду того же состава для доращивания и укоренения При этом среда может быть как плотной с агаром, так и жидкой Как только высаженные черепки сформируют из пазушной почки новый побег, последний вновь черенкуют. Растительные объекты перед стерилизацией тщательно отмывают проточной водой, иногда с моющими средствами очищают от излишних тканей С корнеплодов и корней снимают кожуру, с побегов кору, с почек кроющие чешуи. Вторая Основы цитологических процессов культивируемых клеток и способы культивации Культивирование клеток бактерий.

Экспоненциальная фаза характерна скачком количестве и или размерах клеток, находящихся культуре Обычно продолжается относительно недолго, что связано с накоплением продуктов метаболизма, нехваткой питательных веществ и места емкости. Стационарная фаза, что следует из названия, характерна меньшей чувствительностью к физическим и химическим изменениям среды Клетки почти не делятся, растут медленно Им на этом этапе нужна только энергия для поддержания жизнедеятельности. Стабильные открытые системы имеют управляемые постоянные условия, которые позволяют смоделировать глобальные экологические процессы, которые происходят природе многие годы и даже столетия. Смесь из клеток и питательной смеси подаются и смешиваются непосредственно перед входом трубку, что начинает цикл делений и роста клеток.

Изначально культуры клеток приспособили под выращивание и репродукцию таких клетках вирусов Как известно, вирусы имеют обыкновение размножаться только живых клетках, поэтому их репродуцируют, как это ни грустно, живых организмах Есть вирусы, которые можно размножать эмбрионах куриного яйца, но их спектр очень невелик, так что более всего страдают от подобных экспериментов лабораторные мыши Совершенствование методик культивирования клеток животных позволило использовать их для накопления больших количеств вирусного материала с целью производства из него вакцин Сейчас же стало возможным вставить клетки специфические экзогенно полученные гены и получить их экспрессию, а также подтверждена возможность выращивания культуре из одиночной клетки целой популяции Когда такие популяции получают из клетки, выделявшей окружающую среду антитела, то все молекулы антител надосадочной жидкости одинаковы Первое дает возможность получения трансгенных клеток, тканей или организмов, второе незаменимо для получения моноклональных антител Для чего они нужны постараемся рассмотреть дальнейших выпусках. Какую ткань лучше брать для введения культуру, взрослую или эмбриональную, нормальную или опухолевую.

Культуры, полученные из эмбриональных тканей, характеризуются лучшей выживаемостью и более активным ростом по сравнению с соответствующими зрелыми тканями Причиной этого служит низкий уровень специализации и наличие реплицирующихся клетокпредшественников эмбрионах Пролиферативная способность взрослых тканей ниже, они содержат больше неделящихся специализированных клеток Получение первичных культур клеток взрослых тканей и их размножение является более сложной задачей, продолжительность жизни таких культур, как правило, невелика Нормальные ткани дают начало культурам с ограниченным временем жизни, тогда как культуры, полученные из опухолей, способны пролиферировать неограниченно долгое время Дифференцировка нормальных клеток культуре сопровождается обычно полным прекращением пролиферации клеток В культурах опухолевых клеток возможна частичная дифференцировка при сохранении способности к пролиферации. Новый этап развитии биотехнологии связан первую очередь с использованием растительных клеток На настоящий момент на основе растений получают около 25 фармацевтических препаратов Растения это сырье для тонкой химии, а также источник биохимических компонентов для косметических изделий и пищевых добавок Биотехнология стремится увеличить выход ценных продуктов растений, и при необходимости, специалисты изменяют их свойства, а также прививают им способность производить новые не свойственные для них виды продуктов.

Благодаря биотехнологии традиционные методы гибридизации растений расширились и стали проводиться на клеточном уровне С помощью новых методов клеточной инженерии теперь сливают друг с другом клетки разных растений и получают из них новые гибридные растения Новые методы чрезвычайно расширили границы спектра скрещиваемых растений, куда вошли не скрещивающиеся природе виды Однако техническая возможность соединений клеток очень отдаленных видов растений не всегда означает преодоление их биологической несовместимости, поэтому не все гибриды могут сохраняться. Другая проблема связана со сложностью получения достаточных количеств гомогенного растительного материала и стабильных штаммов для достижения этой цели требуются месяцы или даже годы напряженной работы зависимости от особенностей используемого вида. Наиболее экономически выгодно размножение культуре тканей селекционных сортов цветов орхидей, агав, бегоний, хризантем, цикламена, драцены, ириса, лилий, нарцисса, флокса и других. Создание селективных условий, которых выживают лишь гибриды, объединившие геномы родительских клеток. Ассиметричные гибриды бывают устойчивее, плодовитее и жизнеспособнее, чем симметричные, несущие полные наборы генов родительских клеток В целях ассиметричной гибридизации возможна избирательная обработка клеток одного из родителей для разрушения части его хромосом Возможен прицельный перенос нужной хромосомы из клетки клетку.

Клетки со слившейся цитоплазмой, но не ядрами, содержат ядерный геном одного из родителей и то же время совмещают цитоплазматические гены слившихся клеток. Клеточная инженерия не исчерпывается только слиянием клеток как единственным методом Технология культивирования клеток in vitro позволяет осуществлять с ними разнообразные манипуляции В течение многих лет исследуется возможность введения растительные протопласты и животные клетки органелл, отдельных хромосом и целых клеток цианобактерий или зеленых водорослей. Успешно проводятся исследования по созданию ассоциаций клеток различных организмов, смешенных культур клеток двух или более организмов с целью получения искусственных симбиозов выгодного для партнеров сожительства Примерами естественных симбиозов служат лишайники, объединяющие своем составе клетки гриба и водоросли или цианобактерии, система инфузории цианобактерии последние живут цитоплазме инфузории и обеспечивают ее кислородом, ассоциация папоротника и цианобактерии, обеспечивающей папоротник азотом, ассимилированным из воздуха.

Обсуждая 1989 на страницах журнала Trends in Biotechnology перспективы использования биотехнологии разных сферах сельскохозяйственного производства, сотрудники Федерального института Цюрихе Н Гоч и П Ридер пишут о значении таких направлений, как клонирование и перенос растения новых генов, ответственных за устойчивость к заболеваниям и контролирующих образование важных с экономической точки зрения метаболитов Предполагается, что до 2007 будет проведено картирование генов большинства используемых сельском хозяйстве одно и двудольных растений и реализован искусственный перенос них дополнительных генов Перспективы успешного переноса генов, ответственных за фиксацию молекулярного азота, пока оценивается невысоко изза трудности решения этой проблемы На данном этапе повышение эффективности фиксации азота за счет симбиотических и несимбиотических микроорганизмов представляется весьма реальным. Сущность этого метода основан на кипячении раствора испытуемого препарата воде, свободной от окисляющихся веществ, присутствии 25 серной кислоты и 0, 01 раствора перманганата калия течение 10 мин, добавляют 0, 01 раствор щавелевой кислоты, и титруют 0, 01 раствором перманганата калия, после чего определяют окисляемость количество мг кислорода 1 препарата.

 

© Copyright 2017-2018 - articles-seminary.ru